吳雙等

摘要：為開展新城疫病毒（NDV）LaSota疫苗株的反向遺傳操作技術(shù)研究，了解該病毒的準(zhǔn)種分化情況，運(yùn)用雞胚極限稀釋法對(duì)NDV LaSota疫苗株進(jìn)行傳代純化，選擇病毒稀釋度最高、血凝價(jià)較高的雞胚尿囊液作為傳代接種物，傳至第5代，RT-PCR擴(kuò)增序列，測定并分析其全基因組序列，闡述LaSota疫苗株準(zhǔn)種分化情況，為基因工程疫苗的研制奠定了一定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：新城疫病毒；LaSota疫苗株；準(zhǔn)種；極限稀釋法

中圖分類號(hào)： S852.65+7 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：1002-1302（2014）03-0161-03

新城疫（newcastle disease，ND）是由新城疫病毒（newcastle disease virus，NDV）強(qiáng)毒株引起的一種禽類致死性傳染病，是當(dāng)今世界上危害最大的家禽傳染病之一[1-4]，被國際獸疫局（OIE）列為必須呈報(bào)的疫病之一。該病最常侵襲雞和火雞，至少250種鳥類可自然或?qū)嶒?yàn)室感染NDV，且強(qiáng)毒感染能對(duì)其造成100%的死亡率[5]。NDV屬于副黏病毒科，禽腮腺炎病毒屬，其基因組由單股負(fù)鏈RNA構(gòu)成，基因組結(jié)構(gòu)為 3′-NP-P-M-F-HN-L-5′，依次編碼6種結(jié)構(gòu)蛋白：核衣殼蛋白（NP）、磷蛋白（P）、基質(zhì)蛋白（M）、融合蛋白（F）、血凝素-神經(jīng)氨酸酶蛋白（HN）和大分子蛋白（L），其中病毒囊膜表面的2種糖蛋白F和HN是構(gòu)成NDV致病性的主要分子基礎(chǔ)[6]。對(duì)于ND疾病的控制，在發(fā)達(dá)國家以捕殺強(qiáng)毒感染群為主，同時(shí)結(jié)合疫苗接種，而在廣大發(fā)展中國家疫苗接種仍是控制該病的主要手段。NDV經(jīng)典弱毒疫苗毒株LaSota具有抗體提升快、繁殖性能良好、免疫原性好、抗體效價(jià)高、遺傳穩(wěn)定性好等優(yōu)勢，被世界各國廣泛應(yīng)用于雛雞免疫。然而，在長達(dá)近百年的使用過程中，LaSota毒種被反復(fù)雞胚傳代，準(zhǔn)種分化嚴(yán)重。準(zhǔn)種是由Eigen在1971年提出的用于描述同種生物遺傳異質(zhì)性的概念[7]，感染個(gè)體內(nèi)同種病毒的遺傳異質(zhì)性是RNA病毒具有的一種普遍的生物學(xué)特性，實(shí)際上是由一系列基因序列相近而又不完全相同的突變體構(gòu)成的。準(zhǔn)種是病毒基因組突變或重組的結(jié)果，是連續(xù)的遺傳變異、競爭和選擇所產(chǎn)生的[8]。

本研究使用SPF雞胚極限稀釋法對(duì)筆者所在實(shí)驗(yàn)室保存的NDV LaSota病毒株進(jìn)行純化，測定其全基因組序列，以揭示該毒株的準(zhǔn)種遺傳變異，這對(duì)后續(xù)開展該毒株的反向遺傳學(xué)研究具有重要意義，也為基因疫苗的研制奠定了一定的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 病毒和雞胚

LaSota株和NDV陽性血清購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，由江蘇省獸用生物制藥高技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。SPF種蛋購自山東家禽研究所SPF雞場，由本室孵化至所需日齡。

1.2 常用分子生物學(xué)試劑和分子生物學(xué)軟件

Trizol抽提試劑購自Invitrogen公司；DNA凝膠回收試劑盒、大腸桿菌（Escherichia coli）菌種DH5α感受態(tài)細(xì)胞、質(zhì)粒小提試劑盒購自天根生物有限公司；X-Gal、IPTG、dNTPs、6 nt 隨機(jī)引物等購自寶生物工程（大連）有限公司；高保真聚合酶2×LAmp MasterMix購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；EcoRⅠ、DNA Markers購自Fermentas生物工程有限公司；禽白血病反轉(zhuǎn)錄酶、RNA 酶抑制劑、pGEM-T easy 載體vector和瓊脂糖購自Promega公司；焦碳酸二乙酯購自AMRESCO公司；蛋白棟和酵母提取物購自英國OXOID公司；飽和酚、三氯甲烷、異丙醇等常規(guī)試劑購自生工生物有限公司；其余試劑均為國內(nèi)分析純；磷酸鹽緩沖液（PBS）、1%雞紅細(xì)胞按OIE標(biāo)準(zhǔn)方法自制。Primer Premier 5.0和DNAStar 4.0版本軟件包中的分析軟件有DNASTAR Inc. Madison、WI153715，USA。

1.3 NDV LaSota株復(fù)壯和增殖

取-80 ℃保存的LaSota種毒，室溫融化，用無菌PBS進(jìn)行10-6稀釋，按0.2 mL/胚接種到9～11日齡SPF雞胚上，37 ℃ 孵育，每12 h觀察1次，觀察120 h。棄去24 h內(nèi)死亡的雞胚，將24 h以后死亡及120 h以后未死亡的雞胚置于 4 ℃ 冰箱中過夜，收集尿囊液，單胚單收，逐個(gè)測定每胚尿囊液的血凝價(jià)（HA效價(jià)），從所收獲的尿囊液中挑選HA效價(jià)高的尿囊液，保存于-80 ℃冰箱。HA試驗(yàn)按OIE 標(biāo)定的β微量法進(jìn)行。

1.4 NDV LaSota株純化和篩選

毒種純化采用雞胚極限稀釋法，將HA效價(jià)高的尿囊液作10倍系列稀釋至10-10，然后取10-6、10-7、10-8、10-9、10-10等5個(gè)連續(xù)稀釋度的尿囊液，按0.1 mL/胚接種到9～11日齡SPF雞胚上，每個(gè)稀釋度接種雞胚5枚，接種后置于 37 ℃ 溫箱孵育，逐個(gè)收獲24～120 h死亡雞胚及120 h 后存活雞胚的尿囊液，無菌操作，單胚單收，分別測定每個(gè)雞胚尿囊液的血凝價(jià)。同時(shí)，根據(jù)Reed-Muench法計(jì)算雞胚半數(shù)感染量（EID50）。選擇病毒稀釋度最高、血凝價(jià) HA 較高的雞胚尿囊液作為傳代接種物，按上述方法進(jìn)行，繼續(xù)病毒接種傳代。

1.5 引物設(shè)計(jì)與合成

參考GenBank中NDV LaSota的全基因組序列，利用Premier 5.0設(shè)計(jì)10對(duì)引物，相鄰擴(kuò)增片段之間有50～200 nt核酸序列相互重疊，拼接起來可以覆蓋NDV全基因組。引物序列見表1，引物均由上海Invitrogen公司合成。

測序比對(duì)結(jié)果表明，純化株與原病毒株在基因序列上并沒有太大差異，HN蛋白氨基酸突變率最高，為0.29%，M蛋白和F蛋白沒有突變，說明該純化株仍為LaSota病毒株，沒有在篩選傳代的過程中發(fā)生根本變異。

將此純化株分別與GenBank上的LaSota（登錄號(hào)分別為AF077761.1、AY845400.2和JF950510.1）全基因組序列相比，核苷酸的同源性分別為99.2%、99.0%和99.6%，突變主要集中在L和HN蛋白上。3 結(jié)論與討論

準(zhǔn)種是同一株病毒在宿主體內(nèi)表現(xiàn)為一群系統(tǒng)發(fā)育密切相關(guān)的變異株，它是由一定數(shù)量核苷酸相同的優(yōu)勢準(zhǔn)種和序列互不相同的劣勢準(zhǔn)種組成的。RNA依賴的RNA聚合酶因缺乏3′→5′核酸外切酶活性而使復(fù)制中產(chǎn)生的錯(cuò)誤未能校正、宿主本身的選擇（正選擇作用）和病毒基因組結(jié)構(gòu)的限制（負(fù)選擇作用）3種機(jī)制會(huì)導(dǎo)致優(yōu)勢準(zhǔn)種不固定，在一些外界選擇壓力作用下，劣勢準(zhǔn)種甚至可替代優(yōu)勢準(zhǔn)種。

為了更好地開展該毒株的反向遺傳操作技術(shù)研究，在病毒純化過程中，有必要進(jìn)行幾個(gè)病毒克隆株的篩選，以獲得一株能代表絕大多數(shù)病毒克隆株性質(zhì)的克隆株。首先，在病毒傳代過程中考慮到疫苗制備需要，每次應(yīng)選擇病毒稀釋度最高、血凝價(jià)較高的尿囊液作為傳代接種物；其次，擴(kuò)增基因片段時(shí)選擇高保真聚合酶，PCR循環(huán)數(shù)設(shè)為25次；最后，為避免PCR 過程可能造成基因的變異以及測序過程中可能帶來的突變，對(duì)該病毒基因片段至少測序5個(gè)陽性克隆，綜合多次測序結(jié)果獲得其全長基因序列，因此所獲得的序列應(yīng)該能夠真實(shí)反映該病毒株基因組的核苷酸序列。

純化株序列與種毒株序列以及GenBank 中的3株 LaSota 株序列相比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)核苷酸發(fā)生變異，表明該疫苗株是在自然界的選擇壓力與免疫壓力下對(duì)外界環(huán)境變化而發(fā)生的一種適應(yīng)性突變。NDV囊膜表面的F和HN等2個(gè)糖蛋白容易經(jīng)受選擇壓力的作用，同時(shí)也是構(gòu)成NDV主要致病性的分子基礎(chǔ)[10]。Peeters 等在1999年發(fā)現(xiàn)尤其是F蛋白在NDV致病過程中發(fā)揮著重要作用[2]。然而，鞏艷艷等在2009年抗體免疫選擇壓可顯著影響HN基因變異，且其受影響程度高于F基因，認(rèn)為HN基因的變異更能代表NDV 的進(jìn)化規(guī)律和趨勢[11]。筆者發(fā)現(xiàn)F蛋白沒有發(fā)生突變，而HN蛋白的突變率最高，堿基突變率達(dá)到了0.29%，與鞏艷艷等的研究結(jié)果[11]一致。本研究結(jié)果在一定程度上也表明NDV的進(jìn)化是多個(gè)基因包括調(diào)控區(qū)共同演化的結(jié)果。

參考文獻(xiàn)：

[1]于 洋，封振，何孔旺，等. 新城疫病毒毒力分子機(jī)制研究進(jìn)展[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2013，29（2）：435-439.

[2]梁淑珍，郭 兵，王海風(fēng). 中藥復(fù)方對(duì)雞新城疫疫苗免疫效果的影響[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，40（2）：176-178.

[3]段志強(qiáng)，胡 嬌，胡增壘，等. 鵝源新城疫病毒M基因的原核表達(dá)及其多克隆抗體制備[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2012，28（1）：125-130.

[4]魏 寧，桂文龍，李巨銀，等. 新城疫疫苗及免疫程序?qū)Φ半u免疫效果的研究[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，40（11）：232-234.

[5]Qiu X，Sun Q，Wu S，et al. Entire genome sequence analysis of genotype IX newcastle disease viruses reveals their early-genotype phylogenetic position and recent-genotype genome size[J]. Virology Journal，2011，8：117.

[6]Peeters B H，de Leeuw O S，Koch G，et al. Rescue of NDV from cloned cDNA：evidence that cleavability of fusion protein is a major determinant for virulence[J]. Virology Journal，1999，73（6）：5001-5009.

[7]Eigen M. Selforganization of matter and the evolution of biological macromolecules[J]. Naturwissenschaften，1971，58（10）：465-523.

[8]Kissi B，Badrane H，Audry L，et al. Dynamics of rabies virus quasispecies during serial passages in heterologous hosts[J]. Journal of General Virology，1999，80（8）：2041-2050.

[9]Liu X，Wang X，Wu S，et al. Surveillance for avirulent newcastle disease viruses in domestic ducks （Anas platyrhynchos and Cairina moschata） at live bird markets in Eastern China and characterization of the viruses isolated[J]. Journal of the W V P A，2009，38（5）：377-391.

[10]aldous E W，Mynn J K，Banks J，et al. A molecular epidemiological study of avian paramyxovirus type 1（newcastle disease virus）isolates by phylogenetic analysis of a partial nucleotide sequence of the fusion protein gene[J]. Journal of the W V P A，2003，32：239-257.

[11]鞏艷艷，崔治中. 細(xì)胞培養(yǎng)上新城疫病毒HN基因在抗體免疫選擇壓作用下的抗原表位變異[J]. 中國科學(xué)，2009，39（12）：1175-1180.

將此純化株分別與GenBank上的LaSota（登錄號(hào)分別為AF077761.1、AY845400.2和JF950510.1）全基因組序列相比，核苷酸的同源性分別為99.2%、99.0%和99.6%，突變主要集中在L和HN蛋白上。3 結(jié)論與討論

準(zhǔn)種是同一株病毒在宿主體內(nèi)表現(xiàn)為一群系統(tǒng)發(fā)育密切相關(guān)的變異株，它是由一定數(shù)量核苷酸相同的優(yōu)勢準(zhǔn)種和序列互不相同的劣勢準(zhǔn)種組成的。RNA依賴的RNA聚合酶因缺乏3′→5′核酸外切酶活性而使復(fù)制中產(chǎn)生的錯(cuò)誤未能校正、宿主本身的選擇（正選擇作用）和病毒基因組結(jié)構(gòu)的限制（負(fù)選擇作用）3種機(jī)制會(huì)導(dǎo)致優(yōu)勢準(zhǔn)種不固定，在一些外界選擇壓力作用下，劣勢準(zhǔn)種甚至可替代優(yōu)勢準(zhǔn)種。

為了更好地開展該毒株的反向遺傳操作技術(shù)研究，在病毒純化過程中，有必要進(jìn)行幾個(gè)病毒克隆株的篩選，以獲得一株能代表絕大多數(shù)病毒克隆株性質(zhì)的克隆株。首先，在病毒傳代過程中考慮到疫苗制備需要，每次應(yīng)選擇病毒稀釋度最高、血凝價(jià)較高的尿囊液作為傳代接種物；其次，擴(kuò)增基因片段時(shí)選擇高保真聚合酶，PCR循環(huán)數(shù)設(shè)為25次；最后，為避免PCR 過程可能造成基因的變異以及測序過程中可能帶來的突變，對(duì)該病毒基因片段至少測序5個(gè)陽性克隆，綜合多次測序結(jié)果獲得其全長基因序列，因此所獲得的序列應(yīng)該能夠真實(shí)反映該病毒株基因組的核苷酸序列。

純化株序列與種毒株序列以及GenBank 中的3株 LaSota 株序列相比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)核苷酸發(fā)生變異，表明該疫苗株是在自然界的選擇壓力與免疫壓力下對(duì)外界環(huán)境變化而發(fā)生的一種適應(yīng)性突變。NDV囊膜表面的F和HN等2個(gè)糖蛋白容易經(jīng)受選擇壓力的作用，同時(shí)也是構(gòu)成NDV主要致病性的分子基礎(chǔ)[10]。Peeters 等在1999年發(fā)現(xiàn)尤其是F蛋白在NDV致病過程中發(fā)揮著重要作用[2]。然而，鞏艷艷等在2009年抗體免疫選擇壓可顯著影響HN基因變異，且其受影響程度高于F基因，認(rèn)為HN基因的變異更能代表NDV 的進(jìn)化規(guī)律和趨勢[11]。筆者發(fā)現(xiàn)F蛋白沒有發(fā)生突變，而HN蛋白的突變率最高，堿基突變率達(dá)到了0.29%，與鞏艷艷等的研究結(jié)果[11]一致。本研究結(jié)果在一定程度上也表明NDV的進(jìn)化是多個(gè)基因包括調(diào)控區(qū)共同演化的結(jié)果。

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將此純化株分別與GenBank上的LaSota（登錄號(hào)分別為AF077761.1、AY845400.2和JF950510.1）全基因組序列相比，核苷酸的同源性分別為99.2%、99.0%和99.6%，突變主要集中在L和HN蛋白上。3 結(jié)論與討論

準(zhǔn)種是同一株病毒在宿主體內(nèi)表現(xiàn)為一群系統(tǒng)發(fā)育密切相關(guān)的變異株，它是由一定數(shù)量核苷酸相同的優(yōu)勢準(zhǔn)種和序列互不相同的劣勢準(zhǔn)種組成的。RNA依賴的RNA聚合酶因缺乏3′→5′核酸外切酶活性而使復(fù)制中產(chǎn)生的錯(cuò)誤未能校正、宿主本身的選擇（正選擇作用）和病毒基因組結(jié)構(gòu)的限制（負(fù)選擇作用）3種機(jī)制會(huì)導(dǎo)致優(yōu)勢準(zhǔn)種不固定，在一些外界選擇壓力作用下，劣勢準(zhǔn)種甚至可替代優(yōu)勢準(zhǔn)種。

為了更好地開展該毒株的反向遺傳操作技術(shù)研究，在病毒純化過程中，有必要進(jìn)行幾個(gè)病毒克隆株的篩選，以獲得一株能代表絕大多數(shù)病毒克隆株性質(zhì)的克隆株。首先，在病毒傳代過程中考慮到疫苗制備需要，每次應(yīng)選擇病毒稀釋度最高、血凝價(jià)較高的尿囊液作為傳代接種物；其次，擴(kuò)增基因片段時(shí)選擇高保真聚合酶，PCR循環(huán)數(shù)設(shè)為25次；最后，為避免PCR 過程可能造成基因的變異以及測序過程中可能帶來的突變，對(duì)該病毒基因片段至少測序5個(gè)陽性克隆，綜合多次測序結(jié)果獲得其全長基因序列，因此所獲得的序列應(yīng)該能夠真實(shí)反映該病毒株基因組的核苷酸序列。

純化株序列與種毒株序列以及GenBank 中的3株 LaSota 株序列相比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)核苷酸發(fā)生變異，表明該疫苗株是在自然界的選擇壓力與免疫壓力下對(duì)外界環(huán)境變化而發(fā)生的一種適應(yīng)性突變。NDV囊膜表面的F和HN等2個(gè)糖蛋白容易經(jīng)受選擇壓力的作用，同時(shí)也是構(gòu)成NDV主要致病性的分子基礎(chǔ)[10]。Peeters 等在1999年發(fā)現(xiàn)尤其是F蛋白在NDV致病過程中發(fā)揮著重要作用[2]。然而，鞏艷艷等在2009年抗體免疫選擇壓可顯著影響HN基因變異，且其受影響程度高于F基因，認(rèn)為HN基因的變異更能代表NDV 的進(jìn)化規(guī)律和趨勢[11]。筆者發(fā)現(xiàn)F蛋白沒有發(fā)生突變，而HN蛋白的突變率最高，堿基突變率達(dá)到了0.29%，與鞏艷艷等的研究結(jié)果[11]一致。本研究結(jié)果在一定程度上也表明NDV的進(jìn)化是多個(gè)基因包括調(diào)控區(qū)共同演化的結(jié)果。

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