潘曉曦+關(guān)一鳴+吳連舉

摘要：菌株B-09是1株從人參根際土壤中篩選出的生防菌。為明確B-09菌株在人參灰霉病生防應(yīng)用中的潛力，進(jìn)行了B-09室內(nèi)抑菌效果和溫室防治效果試驗(yàn)。結(jié)果表明，室內(nèi)抑菌試驗(yàn)B-09活體菌株對人參灰霉病病原菌的抑菌圈直徑達(dá)32 mm；B-09無菌發(fā)酵液對人參灰霉病病原菌菌絲生長的抑制率達(dá)90%以上，對人參灰霉病病原菌孢子萌發(fā)的抑制率達(dá)87%以上。在溫室控病試驗(yàn)中，B-09無菌發(fā)酵液對人參灰霉病的防治效果達(dá)78.6%左右，與化學(xué)藥劑處理組效果相當(dāng)，表明供試生防菌可開發(fā)為生物農(nóng)藥的潛力。

關(guān)鍵詞：生防菌；人參灰霉?。灰志饔?；生物防治

中圖分類號： S435.675 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號：1002-1302（2014）03-0074-02

人參為五加科多年生草本植物，以根莖、葉、花、果實(shí)入藥，具有大補(bǔ)元?dú)?、?fù)脈固脫、補(bǔ)氣益血、生津、安神等功效[1]。人參灰霉病是20世紀(jì)80年代國內(nèi)新發(fā)現(xiàn)的病害，該病以危害人參的葉片、葉柄、花、果實(shí)為主，嚴(yán)重時(shí)危害根部，1981—1988年吉林省栽培人參該病的發(fā)病率達(dá)20%～30%。自2002年以來，吉林省人參灰霉病發(fā)生頻繁，已成為影響人參產(chǎn)量的主要病害之一[2]。目前，該病的防治主要以化學(xué)防治為主，由于長期大量使用化學(xué)農(nóng)藥，給生態(tài)環(huán)境、藥材品質(zhì)帶來了不可忽視的危害；另外因植物病原菌對常用化學(xué)藥劑抗藥性的逐漸增強(qiáng)，使其防效不斷下降。因此，有針對性地使用生物農(nóng)藥，開發(fā)微生物殺菌劑是植物病害防治的必然趨勢。試驗(yàn)以抗菌譜較廣的生防菌B-09為材料，對菌株的抑菌活性和控病作用開展了研究，明確了生防菌B-09對人參灰霉病的抑制效果，為進(jìn)一步開發(fā)生物農(nóng)藥奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試生防菌枯草芽孢桿菌B-09，分離自吉林省撫松縣人參根際土壤。供試病原菌人參灰霉病病原菌，分離自吉林省吉安市人參種植基地人參灰霉病病株。化學(xué)藥劑。80%多菌靈可濕性粉劑，北京綠怡園科技發(fā)展有限公司生產(chǎn)。培養(yǎng)基。PDA培養(yǎng)基、NA培養(yǎng)基、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 生防菌B-09無菌發(fā)酵液的制備 將菌株B-09接種于NA培養(yǎng)基活化24 h后，取直徑3mm的菌餅轉(zhuǎn)接于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，于37 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)72 h，離心后取上清液，再用0.22 μm微孔濾膜濾去上清液中殘留菌體，制得B-09無菌發(fā)酵液。

1.2.2 B-09菌株平板內(nèi)拮抗作用 利用平板對峙法[3]，在PDA平板中央接種直徑為6 mm的病原菌菌餅，距菌餅 25 mm 處用接種針點(diǎn)接生防菌，以不接生防菌的PDA平板作為空白對照，于25 ℃溫箱培養(yǎng)，6 d后檢測生防菌株對病原菌菌絲生長的抑制作用，并測定抑菌圈直徑大小。每處理3次重復(fù)（下同）。

1.2.3 B-09無菌發(fā)酵液對病原菌菌絲生長的抑制作用 將B-09無菌發(fā)酵液與冷卻至50 ℃左右的PDA培養(yǎng)基分別以1 ∶ 4、1 ∶ 6、1 ∶ 10、1 ∶ 18的體積比混勻（發(fā)酵液終濃度為20%、14%、9%、5%）倒平板，冷卻后于平板中央接種直徑 6 mm 病原菌菌餅，以裝有營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基與PDA培養(yǎng)基混合物的平板為對照，比例同上，于“1.2.2”節(jié)的條件下培養(yǎng) 6 d 后測量各處理病原菌菌絲直徑，并計(jì)算抑制率。

1.2.4 B-09無菌發(fā)酵液對病原菌孢子萌發(fā)的抑制作用 用無菌水配制灰霉病病原菌孢子懸浮液，濃度為1×106 CFU/mL。將B-09無菌發(fā)酵液100%、50%、25%的稀釋液與等體積的灰霉病病原菌孢子懸浮液混合（發(fā)酵液終濃度為50%、25%、125%），用載玻片懸滴法[4]于25 ℃培養(yǎng)，以加入營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基的孢子懸浮液為對照，24 h后鏡檢孢子萌發(fā)情況。

1.2.5 B-09無菌發(fā)酵液對人參灰霉病防治試驗(yàn) 取3年生人參盆栽苗，每株人參苗針刺8個(gè)傷口，用人參灰霉病病原菌孢子懸浮液（濃度約為2×105 CFU/mL）噴灑接種，接種后保濕，36 h 后噴灑B-09無菌發(fā)酵液，6株為1處理，每處理設(shè)3次重復(fù)。10 d后觀察發(fā)病情況，統(tǒng)計(jì)發(fā)病率和病情指數(shù)，并計(jì)算防治效果[5-6]。對照組和化學(xué)藥劑組分別噴灑無菌水與多菌靈1 000倍液。病情分級標(biāo)準(zhǔn)如下[7]：0級，無病斑；1級，病斑面積占整個(gè)葉面積5%以下；3級，病斑面積占整個(gè)葉面積6%～10%；5級，病斑面積占整個(gè)葉面積11%～20%；7級，病斑面積占整個(gè)葉面積21%～50%；9級，病斑面積占整個(gè)葉面積50%以上。

2 結(jié)果與分析

2.1 B-09菌株平板內(nèi)抑菌效果

從圖1可見，生防菌與灰霉病病原菌對峙培養(yǎng)6 d后，在生防菌周圍形成直徑為32 mm的透明抑菌圈，且直徑大小不隨時(shí)間的推移而改變。顯微鏡下觀察可見，抑菌圈周圍的病原菌菌絲生長緩慢，部分菌絲頂端膨大，并且細(xì)胞壁被破壞，原生質(zhì)體外泄，表現(xiàn)出溶菌現(xiàn)象（圖2）。

2.2 B-09菌株無菌發(fā)酵液對病原菌菌絲生長的抑制作用

從表1可見，B-09無菌發(fā)酵液在5.0%的濃度下對菌絲生長有抑制作用，但效果不明顯；在14%、20%濃度下的抑菌效果較好，且二者沒有顯著差異。表明分無菌發(fā)酵液在14%的濃度下已能有效抑制病原菌菌絲的生長。

3 討論與結(jié)論

近年來，某些國家正在逐漸淘汰化學(xué)農(nóng)藥，越來越多采用生物農(nóng)藥和生物肥料等生物防治措施控制和消滅植物病蟲害，并取得了顯著進(jìn)展[8-9]。生物農(nóng)藥包括細(xì)菌農(nóng)藥、真菌農(nóng)藥、病毒農(nóng)藥和抗生素農(nóng)藥四大類。由于生物農(nóng)藥具有選擇性強(qiáng)、效率高、成本低、不污染環(huán)境、對人畜無害等特點(diǎn)，某些國家正越來越多地將其應(yīng)用于農(nóng)作物防病、治蟲、防草等方面，推廣應(yīng)用前景廣泛。

生防菌B-09是從200余個(gè)人參土壤根際菌中經(jīng)過反復(fù)篩選后獲得的抗菌活性很強(qiáng)的菌株。試驗(yàn)結(jié)果表明，供試菌株的活菌體能夠良好地抑制人參灰霉病病原菌菌絲的生長能力；菌株的無菌發(fā)酵液對人參灰霉病病原菌菌絲生長與孢子萌發(fā)均表現(xiàn)出顯著的抑制作用。在溫室盆栽試驗(yàn)中，B-09無菌發(fā)酵液對人參灰霉病的防治效果達(dá)到78.6%，與常用化學(xué)農(nóng)藥效果相當(dāng)，但溫室是一個(gè)相對可控的系統(tǒng)，影響因素相對于田間要少，菌株B-09雖然具有一定開發(fā)為生物農(nóng)藥的潛力，但防控效果還需要進(jìn)一步進(jìn)行田間試驗(yàn)來驗(yàn)證。

參考文獻(xiàn)：

[1]楊春澍.藥用植物學(xué)[M]. 上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1998：251-252.

[2]徐懷友，馬友德，張 輝，等. 人參灰霉病安全高效防治藥劑組合篩選研究[J]. 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，30（專輯）：44-47.

3]李小俊，成麗霞，吳彥彬，等. 拮抗菌抗菌譜及發(fā)酵液拮抗能力測定的新方法[J]. 生物技術(shù)，2007，17（1）：55-58.

[4]方中達(dá). 植病研究方法[M]. 北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，1998：152.

[5]Brunner K，Zeilinger S，Ciliento R，et al. Improvement of the Fungal Biocontrol Agent Trichoderma atroviride to Enhance both Antagonism and Induction of Plant Systemic Disease Resistance[J]. Applied and Environmental Microbiology，2005，71（7）：3959-3962.

[6]農(nóng)業(yè)部農(nóng)藥檢定所. 農(nóng)藥田間藥效試驗(yàn)準(zhǔn)則（一）[M]. 北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社. 1998：45-51.

[7]王存興，李光武. 植物病理學(xué)[M]. 北京：化學(xué)工業(yè)出版社. 2012：92-94.

[8]陳志誼，張榮勝. 植物病害生防芽孢桿菌研究進(jìn)展[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2012，28（5）：999-1006.

[9]楊敬輝，吉沐祥，文平蘭，等. 黃麻鏈霉菌NF0919菌株對水稻紋枯病的生防活性[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2012，28（6）：1288-1293.

摘要：菌株B-09是1株從人參根際土壤中篩選出的生防菌。為明確B-09菌株在人參灰霉病生防應(yīng)用中的潛力，進(jìn)行了B-09室內(nèi)抑菌效果和溫室防治效果試驗(yàn)。結(jié)果表明，室內(nèi)抑菌試驗(yàn)B-09活體菌株對人參灰霉病病原菌的抑菌圈直徑達(dá)32 mm；B-09無菌發(fā)酵液對人參灰霉病病原菌菌絲生長的抑制率達(dá)90%以上，對人參灰霉病病原菌孢子萌發(fā)的抑制率達(dá)87%以上。在溫室控病試驗(yàn)中，B-09無菌發(fā)酵液對人參灰霉病的防治效果達(dá)78.6%左右，與化學(xué)藥劑處理組效果相當(dāng)，表明供試生防菌可開發(fā)為生物農(nóng)藥的潛力。

關(guān)鍵詞：生防菌；人參灰霉病；抑菌作用；生物防治

中圖分類號： S435.675 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號：1002-1302（2014）03-0074-02

人參為五加科多年生草本植物，以根莖、葉、花、果實(shí)入藥，具有大補(bǔ)元?dú)?、?fù)脈固脫、補(bǔ)氣益血、生津、安神等功效[1]。人參灰霉病是20世紀(jì)80年代國內(nèi)新發(fā)現(xiàn)的病害，該病以危害人參的葉片、葉柄、花、果實(shí)為主，嚴(yán)重時(shí)危害根部，1981—1988年吉林省栽培人參該病的發(fā)病率達(dá)20%～30%。自2002年以來，吉林省人參灰霉病發(fā)生頻繁，已成為影響人參產(chǎn)量的主要病害之一[2]。目前，該病的防治主要以化學(xué)防治為主，由于長期大量使用化學(xué)農(nóng)藥，給生態(tài)環(huán)境、藥材品質(zhì)帶來了不可忽視的危害；另外因植物病原菌對常用化學(xué)藥劑抗藥性的逐漸增強(qiáng)，使其防效不斷下降。因此，有針對性地使用生物農(nóng)藥，開發(fā)微生物殺菌劑是植物病害防治的必然趨勢。試驗(yàn)以抗菌譜較廣的生防菌B-09為材料，對菌株的抑菌活性和控病作用開展了研究，明確了生防菌B-09對人參灰霉病的抑制效果，為進(jìn)一步開發(fā)生物農(nóng)藥奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試生防菌枯草芽孢桿菌B-09，分離自吉林省撫松縣人參根際土壤。供試病原菌人參灰霉病病原菌，分離自吉林省吉安市人參種植基地人參灰霉病病株?；瘜W(xué)藥劑。80%多菌靈可濕性粉劑，北京綠怡園科技發(fā)展有限公司生產(chǎn)。培養(yǎng)基。PDA培養(yǎng)基、NA培養(yǎng)基、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 生防菌B-09無菌發(fā)酵液的制備 將菌株B-09接種于NA培養(yǎng)基活化24 h后，取直徑3mm的菌餅轉(zhuǎn)接于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，于37 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)72 h，離心后取上清液，再用0.22 μm微孔濾膜濾去上清液中殘留菌體，制得B-09無菌發(fā)酵液。

1.2.2 B-09菌株平板內(nèi)拮抗作用 利用平板對峙法[3]，在PDA平板中央接種直徑為6 mm的病原菌菌餅，距菌餅 25 mm 處用接種針點(diǎn)接生防菌，以不接生防菌的PDA平板作為空白對照，于25 ℃溫箱培養(yǎng)，6 d后檢測生防菌株對病原菌菌絲生長的抑制作用，并測定抑菌圈直徑大小。每處理3次重復(fù)（下同）。

1.2.3 B-09無菌發(fā)酵液對病原菌菌絲生長的抑制作用 將B-09無菌發(fā)酵液與冷卻至50 ℃左右的PDA培養(yǎng)基分別以1 ∶ 4、1 ∶ 6、1 ∶ 10、1 ∶ 18的體積比混勻（發(fā)酵液終濃度為20%、14%、9%、5%）倒平板，冷卻后于平板中央接種直徑 6 mm 病原菌菌餅，以裝有營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基與PDA培養(yǎng)基混合物的平板為對照，比例同上，于“1.2.2”節(jié)的條件下培養(yǎng) 6 d 后測量各處理病原菌菌絲直徑，并計(jì)算抑制率。

1.2.4 B-09無菌發(fā)酵液對病原菌孢子萌發(fā)的抑制作用 用無菌水配制灰霉病病原菌孢子懸浮液，濃度為1×106 CFU/mL。將B-09無菌發(fā)酵液100%、50%、25%的稀釋液與等體積的灰霉病病原菌孢子懸浮液混合（發(fā)酵液終濃度為50%、25%、125%），用載玻片懸滴法[4]于25 ℃培養(yǎng)，以加入營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基的孢子懸浮液為對照，24 h后鏡檢孢子萌發(fā)情況。

1.2.5 B-09無菌發(fā)酵液對人參灰霉病防治試驗(yàn) 取3年生人參盆栽苗，每株人參苗針刺8個(gè)傷口，用人參灰霉病病原菌孢子懸浮液（濃度約為2×105 CFU/mL）噴灑接種，接種后保濕，36 h 后噴灑B-09無菌發(fā)酵液，6株為1處理，每處理設(shè)3次重復(fù)。10 d后觀察發(fā)病情況，統(tǒng)計(jì)發(fā)病率和病情指數(shù)，并計(jì)算防治效果[5-6]。對照組和化學(xué)藥劑組分別噴灑無菌水與多菌靈1 000倍液。病情分級標(biāo)準(zhǔn)如下[7]：0級，無病斑；1級，病斑面積占整個(gè)葉面積5%以下；3級，病斑面積占整個(gè)葉面積6%～10%；5級，病斑面積占整個(gè)葉面積11%～20%；7級，病斑面積占整個(gè)葉面積21%～50%；9級，病斑面積占整個(gè)葉面積50%以上。

2 結(jié)果與分析

2.1 B-09菌株平板內(nèi)抑菌效果

從圖1可見，生防菌與灰霉病病原菌對峙培養(yǎng)6 d后，在生防菌周圍形成直徑為32 mm的透明抑菌圈，且直徑大小不隨時(shí)間的推移而改變。顯微鏡下觀察可見，抑菌圈周圍的病原菌菌絲生長緩慢，部分菌絲頂端膨大，并且細(xì)胞壁被破壞，原生質(zhì)體外泄，表現(xiàn)出溶菌現(xiàn)象（圖2）。

2.2 B-09菌株無菌發(fā)酵液對病原菌菌絲生長的抑制作用

從表1可見，B-09無菌發(fā)酵液在5.0%的濃度下對菌絲生長有抑制作用，但效果不明顯；在14%、20%濃度下的抑菌效果較好，且二者沒有顯著差異。表明分無菌發(fā)酵液在14%的濃度下已能有效抑制病原菌菌絲的生長。

3 討論與結(jié)論

近年來，某些國家正在逐漸淘汰化學(xué)農(nóng)藥，越來越多采用生物農(nóng)藥和生物肥料等生物防治措施控制和消滅植物病蟲害，并取得了顯著進(jìn)展[8-9]。生物農(nóng)藥包括細(xì)菌農(nóng)藥、真菌農(nóng)藥、病毒農(nóng)藥和抗生素農(nóng)藥四大類。由于生物農(nóng)藥具有選擇性強(qiáng)、效率高、成本低、不污染環(huán)境、對人畜無害等特點(diǎn)，某些國家正越來越多地將其應(yīng)用于農(nóng)作物防病、治蟲、防草等方面，推廣應(yīng)用前景廣泛。

生防菌B-09是從200余個(gè)人參土壤根際菌中經(jīng)過反復(fù)篩選后獲得的抗菌活性很強(qiáng)的菌株。試驗(yàn)結(jié)果表明，供試菌株的活菌體能夠良好地抑制人參灰霉病病原菌菌絲的生長能力；菌株的無菌發(fā)酵液對人參灰霉病病原菌菌絲生長與孢子萌發(fā)均表現(xiàn)出顯著的抑制作用。在溫室盆栽試驗(yàn)中，B-09無菌發(fā)酵液對人參灰霉病的防治效果達(dá)到78.6%，與常用化學(xué)農(nóng)藥效果相當(dāng)，但溫室是一個(gè)相對可控的系統(tǒng)，影響因素相對于田間要少，菌株B-09雖然具有一定開發(fā)為生物農(nóng)藥的潛力，但防控效果還需要進(jìn)一步進(jìn)行田間試驗(yàn)來驗(yàn)證。

參考文獻(xiàn)：

[1]楊春澍.藥用植物學(xué)[M]. 上海：上海科學(xué)技術(shù)出版社，1998：251-252.

[2]徐懷友，馬友德，張 輝，等. 人參灰霉病安全高效防治藥劑組合篩選研究[J]. 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，30（專輯）：44-47.

3]李小俊，成麗霞，吳彥彬，等. 拮抗菌抗菌譜及發(fā)酵液拮抗能力測定的新方法[J]. 生物技術(shù)，2007，17（1）：55-58.

[4]方中達(dá). 植病研究方法[M]. 北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，1998：152.

[5]Brunner K，Zeilinger S，Ciliento R，et al. Improvement of the Fungal Biocontrol Agent Trichoderma atroviride to Enhance both Antagonism and Induction of Plant Systemic Disease Resistance[J]. Applied and Environmental Microbiology，2005，71（7）：3959-3962.

[6]農(nóng)業(yè)部農(nóng)藥檢定所. 農(nóng)藥田間藥效試驗(yàn)準(zhǔn)則（一）[M]. 北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社. 1998：45-51.

[7]王存興，李光武. 植物病理學(xué)[M]. 北京：化學(xué)工業(yè)出版社. 2012：92-94.

[8]陳志誼，張榮勝. 植物病害生防芽孢桿菌研究進(jìn)展[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2012，28（5）：999-1006.

[9]楊敬輝，吉沐祥，文平蘭，等. 黃麻鏈霉菌NF0919菌株對水稻紋枯病的生防活性[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2012，28（6）：1288-1293.

摘要：菌株B-09是1株從人參根際土壤中篩選出的生防菌。為明確B-09菌株在人參灰霉病生防應(yīng)用中的潛力，進(jìn)行了B-09室內(nèi)抑菌效果和溫室防治效果試驗(yàn)。結(jié)果表明，室內(nèi)抑菌試驗(yàn)B-09活體菌株對人參灰霉病病原菌的抑菌圈直徑達(dá)32 mm；B-09無菌發(fā)酵液對人參灰霉病病原菌菌絲生長的抑制率達(dá)90%以上，對人參灰霉病病原菌孢子萌發(fā)的抑制率達(dá)87%以上。在溫室控病試驗(yàn)中，B-09無菌發(fā)酵液對人參灰霉病的防治效果達(dá)78.6%左右，與化學(xué)藥劑處理組效果相當(dāng)，表明供試生防菌可開發(fā)為生物農(nóng)藥的潛力。

關(guān)鍵詞：生防菌；人參灰霉??；抑菌作用；生物防治

中圖分類號： S435.675 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號：1002-1302（2014）03-0074-02

人參為五加科多年生草本植物，以根莖、葉、花、果實(shí)入藥，具有大補(bǔ)元?dú)狻?fù)脈固脫、補(bǔ)氣益血、生津、安神等功效[1]。人參灰霉病是20世紀(jì)80年代國內(nèi)新發(fā)現(xiàn)的病害，該病以危害人參的葉片、葉柄、花、果實(shí)為主，嚴(yán)重時(shí)危害根部，1981—1988年吉林省栽培人參該病的發(fā)病率達(dá)20%～30%。自2002年以來，吉林省人參灰霉病發(fā)生頻繁，已成為影響人參產(chǎn)量的主要病害之一[2]。目前，該病的防治主要以化學(xué)防治為主，由于長期大量使用化學(xué)農(nóng)藥，給生態(tài)環(huán)境、藥材品質(zhì)帶來了不可忽視的危害；另外因植物病原菌對常用化學(xué)藥劑抗藥性的逐漸增強(qiáng)，使其防效不斷下降。因此，有針對性地使用生物農(nóng)藥，開發(fā)微生物殺菌劑是植物病害防治的必然趨勢。試驗(yàn)以抗菌譜較廣的生防菌B-09為材料，對菌株的抑菌活性和控病作用開展了研究，明確了生防菌B-09對人參灰霉病的抑制效果，為進(jìn)一步開發(fā)生物農(nóng)藥奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試生防菌枯草芽孢桿菌B-09，分離自吉林省撫松縣人參根際土壤。供試病原菌人參灰霉病病原菌，分離自吉林省吉安市人參種植基地人參灰霉病病株?；瘜W(xué)藥劑。80%多菌靈可濕性粉劑，北京綠怡園科技發(fā)展有限公司生產(chǎn)。培養(yǎng)基。PDA培養(yǎng)基、NA培養(yǎng)基、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 生防菌B-09無菌發(fā)酵液的制備 將菌株B-09接種于NA培養(yǎng)基活化24 h后，取直徑3mm的菌餅轉(zhuǎn)接于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，于37 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)72 h，離心后取上清液，再用0.22 μm微孔濾膜濾去上清液中殘留菌體，制得B-09無菌發(fā)酵液。

1.2.2 B-09菌株平板內(nèi)拮抗作用 利用平板對峙法[3]，在PDA平板中央接種直徑為6 mm的病原菌菌餅，距菌餅 25 mm 處用接種針點(diǎn)接生防菌，以不接生防菌的PDA平板作為空白對照，于25 ℃溫箱培養(yǎng)，6 d后檢測生防菌株對病原菌菌絲生長的抑制作用，并測定抑菌圈直徑大小。每處理3次重復(fù)（下同）。

1.2.3 B-09無菌發(fā)酵液對病原菌菌絲生長的抑制作用 將B-09無菌發(fā)酵液與冷卻至50 ℃左右的PDA培養(yǎng)基分別以1 ∶ 4、1 ∶ 6、1 ∶ 10、1 ∶ 18的體積比混勻（發(fā)酵液終濃度為20%、14%、9%、5%）倒平板，冷卻后于平板中央接種直徑 6 mm 病原菌菌餅，以裝有營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基與PDA培養(yǎng)基混合物的平板為對照，比例同上，于“1.2.2”節(jié)的條件下培養(yǎng) 6 d 后測量各處理病原菌菌絲直徑，并計(jì)算抑制率。

1.2.4 B-09無菌發(fā)酵液對病原菌孢子萌發(fā)的抑制作用 用無菌水配制灰霉病病原菌孢子懸浮液，濃度為1×106 CFU/mL。將B-09無菌發(fā)酵液100%、50%、25%的稀釋液與等體積的灰霉病病原菌孢子懸浮液混合（發(fā)酵液終濃度為50%、25%、125%），用載玻片懸滴法[4]于25 ℃培養(yǎng)，以加入營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基的孢子懸浮液為對照，24 h后鏡檢孢子萌發(fā)情況。

1.2.5 B-09無菌發(fā)酵液對人參灰霉病防治試驗(yàn) 取3年生人參盆栽苗，每株人參苗針刺8個(gè)傷口，用人參灰霉病病原菌孢子懸浮液（濃度約為2×105 CFU/mL）噴灑接種，接種后保濕，36 h 后噴灑B-09無菌發(fā)酵液，6株為1處理，每處理設(shè)3次重復(fù)。10 d后觀察發(fā)病情況，統(tǒng)計(jì)發(fā)病率和病情指數(shù)，并計(jì)算防治效果[5-6]。對照組和化學(xué)藥劑組分別噴灑無菌水與多菌靈1 000倍液。病情分級標(biāo)準(zhǔn)如下[7]：0級，無病斑；1級，病斑面積占整個(gè)葉面積5%以下；3級，病斑面積占整個(gè)葉面積6%～10%；5級，病斑面積占整個(gè)葉面積11%～20%；7級，病斑面積占整個(gè)葉面積21%～50%；9級，病斑面積占整個(gè)葉面積50%以上。

2 結(jié)果與分析

2.1 B-09菌株平板內(nèi)抑菌效果

從圖1可見，生防菌與灰霉病病原菌對峙培養(yǎng)6 d后，在生防菌周圍形成直徑為32 mm的透明抑菌圈，且直徑大小不隨時(shí)間的推移而改變。顯微鏡下觀察可見，抑菌圈周圍的病原菌菌絲生長緩慢，部分菌絲頂端膨大，并且細(xì)胞壁被破壞，原生質(zhì)體外泄，表現(xiàn)出溶菌現(xiàn)象（圖2）。

2.2 B-09菌株無菌發(fā)酵液對病原菌菌絲生長的抑制作用

從表1可見，B-09無菌發(fā)酵液在5.0%的濃度下對菌絲生長有抑制作用，但效果不明顯；在14%、20%濃度下的抑菌效果較好，且二者沒有顯著差異。表明分無菌發(fā)酵液在14%的濃度下已能有效抑制病原菌菌絲的生長。

3 討論與結(jié)論

近年來，某些國家正在逐漸淘汰化學(xué)農(nóng)藥，越來越多采用生物農(nóng)藥和生物肥料等生物防治措施控制和消滅植物病蟲害，并取得了顯著進(jìn)展[8-9]。生物農(nóng)藥包括細(xì)菌農(nóng)藥、真菌農(nóng)藥、病毒農(nóng)藥和抗生素農(nóng)藥四大類。由于生物農(nóng)藥具有選擇性強(qiáng)、效率高、成本低、不污染環(huán)境、對人畜無害等特點(diǎn)，某些國家正越來越多地將其應(yīng)用于農(nóng)作物防病、治蟲、防草等方面，推廣應(yīng)用前景廣泛。

生防菌B-09是從200余個(gè)人參土壤根際菌中經(jīng)過反復(fù)篩選后獲得的抗菌活性很強(qiáng)的菌株。試驗(yàn)結(jié)果表明，供試菌株的活菌體能夠良好地抑制人參灰霉病病原菌菌絲的生長能力；菌株的無菌發(fā)酵液對人參灰霉病病原菌菌絲生長與孢子萌發(fā)均表現(xiàn)出顯著的抑制作用。在溫室盆栽試驗(yàn)中，B-09無菌發(fā)酵液對人參灰霉病的防治效果達(dá)到78.6%，與常用化學(xué)農(nóng)藥效果相當(dāng)，但溫室是一個(gè)相對可控的系統(tǒng)，影響因素相對于田間要少，菌株B-09雖然具有一定開發(fā)為生物農(nóng)藥的潛力，但防控效果還需要進(jìn)一步進(jìn)行田間試驗(yàn)來驗(yàn)證。

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