鄧海娟等

摘要：下載整理了NCBI上公布的相關序列，通過mtDNA CO Ⅰ基因620 bp片段序列對皮蠹科斑皮蠹屬、皮蠹屬、圓皮蠹屬3個屬共30個分析對象的CO Ⅰ基因序列進行分析并構建分子系統(tǒng)樹，結(jié)合形態(tài)學特征分析這3個屬的分子系統(tǒng)發(fā)育關系。結(jié)果顯示，mtDNA CO Ⅰ基因可以作為皮蠹科昆蟲生物系統(tǒng)發(fā)育分子水平上的依據(jù)，為今后深入開展皮蠹科分子系統(tǒng)進化研究奠定一定的理論基礎。

關鍵詞：斑皮蠹屬；皮蠹屬；圓皮蠹屬；mtDNA CO Ⅰ基因；遺傳距離；分子系統(tǒng)樹

中圖分類號： Q969.492.503 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2014）03-0023-04

皮蠹科（Dermestidae）隸屬于鞘翅目皮蠹總科，包括6亞科34屬，約700種，分布在世界各地，我國已知8屬約40種，遍布全國各地。該科昆蟲多為小型甲蟲，生活隱蔽，繁殖力強，食性廣，可取食動物尸體、羽毛、水產(chǎn)品、皮張、藥材等各種儲藏物，是具有重要檢疫意義的儲藏物害蟲[1-2]。昆蟲的mtDNA是一種閉合的雙鏈環(huán)狀遺傳物質(zhì)，穩(wěn)定性高，大小一般為15.4～16.3 kb，以高拷貝數(shù)存在于線粒體內(nèi)，檢測樣品無論是完整還是殘缺，均可通過測定mtDNA序列進行鑒別[3]。mtDNA進化速率較核DNA更快，且為母系遺傳，在遺傳過程中不會發(fā)生基因重組、倒位、易變等突變，是動物種內(nèi)不同地理種群間相對保守又有一定變異的序列，即使是親緣關系很近的類群也存在幾個百分比的差異，所以常被用來反映種群遺傳變異信息，被廣泛應用于不同分類階元的分子系統(tǒng)學研究[4]。皮蠹科昆蟲是十分重要的儲藏物害蟲，我國口岸多有截獲。該科昆蟲分類地位一直存在爭議，準確進行種類鑒定對檢驗檢疫口岸工作具有重要意義。因此，本研究對皮蠹科下斑皮蠹屬（Trogoderma）、皮蠹屬（Dermestes）、圓皮蠹屬（Anthrenus）3個屬共計30個分析對象的CO Ⅰ基因序列進行分析，并構建出不同的分子系統(tǒng)發(fā)育樹，以期在分子水平對這3個屬的系統(tǒng)發(fā)育關系進行探討。

1 材料與方法

1.1 分析對象及序列信息

分析對象共計30個，序列均從GenBank下載，信息見表1。

1.2 DNA序列數(shù)據(jù)的處理

應用Mega 5.0軟件進行序列比對、拼接和剪切。將比對結(jié)果進行序列組成分析，基于Kimura 2-parameter模型計算各分類單元之間的遺傳距離及其標準差、序列堿基組成、保守位點、變異位點、轉(zhuǎn)換/顛換比值等[5]。應用Mega 5.0軟件，使用鄰接法（NJ）、最大簡約法（MP）和最大似然法（ML）分別構建分子系統(tǒng)樹，1 000次循環(huán)估計系統(tǒng)樹中節(jié)點的自舉置信水平，堿基轉(zhuǎn)換和顛換賦予相同的加權值。

2 結(jié)果與分析

2.1 mtDNA CO Ⅰ基因序列組成和變異

應用Mega 5.0軟件對30個分析對象的CO Ⅰ基因序列進行比對剪裁，得到620 bp大小的的序列片段進行分析。所有分析對象的CO Ⅰ基因的620個位點中沒有插入、缺失現(xiàn)象，其中共有104個保守位點，502個變異位點，265個簡約信息位點，保守位點占16.77%，變異位點占80.97%，簡約信息位點占42.74%。A、T、C、G的平均含量分別為32.3%、317%、22.1%、13.9%，A+T含量較高，為64.0%。第3位點的A+T含量最高，達到73.9%；G的含量最低，平均為40%，在不同種間差異也較大（1.1%～13.6%）；A的含量最高，達到47.9%，這表明密碼子的堿基使用頻率存在明顯的偏向性，與典型的昆蟲線粒體DNA堿基組成一致[6]。

2.2 堿基替換分析

采用Mega 5.0軟件對分析對象CO Ⅰ基因序列的替換數(shù)進行分析，由結(jié)果看出，分析對象 CO Ⅰ基因620個核苷酸序列中，核苷酸替換主要發(fā)生在密碼子第3位點上，全體轉(zhuǎn)換/顛換（R）為20.7。

2.3 遺傳距離分析

采用Mega 5.0，基于Kimura 2-param eter模型對分析對象（包括外群）之間的遺傳距離進行分析，并采用Bootstrap重抽樣1 000次進行檢驗，結(jié)果見表2。由表2可知，總體平均遺傳距離為1.017，屬間遺傳距離介于0.466～0.784之間，各種之間遺傳距離介于0～0.875之間，與外群之間的遺傳距離較大，為8.176～8.889，說明皮蠹科3個屬之間的親緣關系相對于外群更接近，且基于CO Ⅰ基因3個屬間可得到有效區(qū)分。

2.4 皮蠹科系統(tǒng)發(fā)育樹構建

以對粒材小蠹為外群，利用Mega 50系統(tǒng)發(fā)育分析軟件對分析對象mtDNA CO Ⅰ序列進行NJ、MP、ML系統(tǒng)發(fā)育樹構建（圖1、圖2、圖3）。

由構建的NJ樹（圖1）來看，屬于圓皮蠹屬中的小圓皮蠹編號為3、4、6的3個對象位于系統(tǒng)樹的一支；圓皮蠹屬中的地毯圓皮蠹獨立位于系統(tǒng)樹的另一支；斑皮蠹屬、皮蠹屬的樣品聚合成另一支，形成3大分支格局。從基因序列數(shù)據(jù)可以看出，圓皮蠹屬中的地毯圓皮蠹和小圓皮蠹樣品之間的遺傳距離為0.737，皮蠹屬中的秘魯皮蠹與斑皮蠹屬各樣品之間的最小遺傳距離為0.466，與圓皮蠹屬各樣品之間的最小遺傳距離為0.784。圓皮蠹屬與斑皮蠹屬各樣品之間的平均遺傳距離為0.59～0.773。以上結(jié)果表明，秘魯皮蠹與斑皮蠹屬各樣品之間的遺傳距離較近，與圓皮蠹屬各樣品之間的遺傳距離相對較遠，這與NJ樹構建結(jié)果相同，符合NJ樹構建規(guī)律。

由構建的MP、ML樹（圖2、圖3）可以發(fā)現(xiàn)，30個分析對象構建的MP、ML系統(tǒng)發(fā)育樹表現(xiàn)出一致的格局，在這2個樹中，斑皮蠹屬、皮蠹屬樣品、圓皮蠹屬的小圓皮蠹樣品聚在一起，圓皮蠹屬的地毯圓皮蠹單獨聚在另一支。圓皮蠹屬位于系統(tǒng)發(fā)育樹的最外緣，斑皮蠹屬的谷斑皮蠹進化速率最快。

從前面的分析來看，昆蟲的密碼子表現(xiàn)出明顯的A+T的含量偏向性，特別是在密碼子第3位，A+T含量很高，該位點的轉(zhuǎn)換較頻繁，并且堿基的替換也主要發(fā)生在第3位點上，但第3位點的轉(zhuǎn)換雖頻繁，卻很少會引起氨基酸的改變，因此將線粒體DNA CO Ⅰ全序列翻譯成氨基酸序列進行2次建樹。

在氨基酸序列NJ系統(tǒng)發(fā)育樹中，斑皮蠹屬、皮蠹屬、圓皮蠹屬分別聚為一支，明顯好于直接用CO Ⅰ序列構建的系統(tǒng)樹。將各發(fā)育樹進行比較發(fā)現(xiàn)結(jié)果基本一致，圓皮蠹屬均聚于最外緣（圖4）。

3 結(jié)論與討論

本研究通過下載整理皮蠹科30個分析對象的mtDNA CO Ⅰ序列并構建了不同分子系統(tǒng)發(fā)育樹，其結(jié)果在一定程度上反映了各屬之間的進化關系與親緣關系，秘魯皮蠹與斑皮蠹屬各分析對象之間的遺傳距離較近，與圓皮蠹屬的遺傳距離相對較遠，斑皮蠹屬較圓皮蠹屬進化速率快。當利用CO Ⅰ基因建樹后結(jié)果不很理想時，可將mtDNA中CO Ⅰ全序列翻譯成氨基酸序列進行2次建樹再次分析，以達到較好結(jié)果。另外，從形態(tài)學來看，地毯圓皮蠹復眼內(nèi)緣凹入，鞘翅具3條狹窄的白色橫帶，翅上以黑色鱗片居多，沿翅縫兩側(cè)尚有紅色鱗片形成的縱帶。而小圓皮蠹復眼內(nèi)緣不凹入，鞘翅上有3條由黃色及白色鱗片構成的波狀橫帶，體背面密生長三角形端部鈍的鱗片，二者雖同屬，卻差別明顯，系統(tǒng)進化樹同樣也驗證了這點，兩者的遺傳距離為0.737（>0.02），達到分子水平不同種的鑒定要求。

目前，NCBI上公布的皮蠹科昆蟲mtDNA CO Ⅰ基因較少，雖然本研究涉及的皮蠹種類不多，但其研究結(jié)果在一定程度上說明了mtDNA CO Ⅰ基因作為遺傳標記應用于皮蠹科系統(tǒng)分類研究是可行的方法之一。在下一步的研究中可增加標本的數(shù)量，以增強分類單元的代表性，通過研究mtDNA CO Ⅰ基因全序列以及其他分子標記基因，使其包含更多的信息量，為皮蠹科不同階元的分類提供更多的分子生物學證據(jù)。

參考文獻：

[1]張生芳，陳洪俊，薛光華. 儲藏物甲蟲彩色圖鑒[M]. 北京：中國農(nóng)業(yè)科學技術出版社，2008：20.

[2]張生芳，劉永平，武增強. 中國儲藏物甲蟲[M]. 北京：中國農(nóng)業(yè)科學技術出版社，1998：100-101.

[3]劉 聰，蔣 湘，班麗萍. 斑皮蠹屬害蟲鑒別方法研究進展[J]. 植物檢疫，2012，26（4）：60-64.

[4]王銀竹，余道堅，張潤杰，等. 基于mtDNA CO Ⅰ基因的十種長小蠹分子系統(tǒng)進化研究[J]. 昆蟲學報，2010，53（4）：457-463.

[5]Tamura K，Peterson D，Peterson N，et al. Mega5：molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihood，evolutionary distance，and maximum parsimony methods[J]. Molecular Biology and Evolution，2011，28（10）：2731-2739.

[6]Liu H，Beckenbach A T.Evolution of mitochondrial cytochrome oxidase Ⅱ gene among the orders of insects[J]. Mol Phylogene Evol，1992，1（1）：41-52.

從前面的分析來看，昆蟲的密碼子表現(xiàn)出明顯的A+T的含量偏向性，特別是在密碼子第3位，A+T含量很高，該位點的轉(zhuǎn)換較頻繁，并且堿基的替換也主要發(fā)生在第3位點上，但第3位點的轉(zhuǎn)換雖頻繁，卻很少會引起氨基酸的改變，因此將線粒體DNA CO Ⅰ全序列翻譯成氨基酸序列進行2次建樹。

在氨基酸序列NJ系統(tǒng)發(fā)育樹中，斑皮蠹屬、皮蠹屬、圓皮蠹屬分別聚為一支，明顯好于直接用CO Ⅰ序列構建的系統(tǒng)樹。將各發(fā)育樹進行比較發(fā)現(xiàn)結(jié)果基本一致，圓皮蠹屬均聚于最外緣（圖4）。

3 結(jié)論與討論

本研究通過下載整理皮蠹科30個分析對象的mtDNA CO Ⅰ序列并構建了不同分子系統(tǒng)發(fā)育樹，其結(jié)果在一定程度上反映了各屬之間的進化關系與親緣關系，秘魯皮蠹與斑皮蠹屬各分析對象之間的遺傳距離較近，與圓皮蠹屬的遺傳距離相對較遠，斑皮蠹屬較圓皮蠹屬進化速率快。當利用CO Ⅰ基因建樹后結(jié)果不很理想時，可將mtDNA中CO Ⅰ全序列翻譯成氨基酸序列進行2次建樹再次分析，以達到較好結(jié)果。另外，從形態(tài)學來看，地毯圓皮蠹復眼內(nèi)緣凹入，鞘翅具3條狹窄的白色橫帶，翅上以黑色鱗片居多，沿翅縫兩側(cè)尚有紅色鱗片形成的縱帶。而小圓皮蠹復眼內(nèi)緣不凹入，鞘翅上有3條由黃色及白色鱗片構成的波狀橫帶，體背面密生長三角形端部鈍的鱗片，二者雖同屬，卻差別明顯，系統(tǒng)進化樹同樣也驗證了這點，兩者的遺傳距離為0.737（>0.02），達到分子水平不同種的鑒定要求。

目前，NCBI上公布的皮蠹科昆蟲mtDNA CO Ⅰ基因較少，雖然本研究涉及的皮蠹種類不多，但其研究結(jié)果在一定程度上說明了mtDNA CO Ⅰ基因作為遺傳標記應用于皮蠹科系統(tǒng)分類研究是可行的方法之一。在下一步的研究中可增加標本的數(shù)量，以增強分類單元的代表性，通過研究mtDNA CO Ⅰ基因全序列以及其他分子標記基因，使其包含更多的信息量，為皮蠹科不同階元的分類提供更多的分子生物學證據(jù)。

參考文獻：

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[5]Tamura K，Peterson D，Peterson N，et al. Mega5：molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihood，evolutionary distance，and maximum parsimony methods[J]. Molecular Biology and Evolution，2011，28（10）：2731-2739.

[6]Liu H，Beckenbach A T.Evolution of mitochondrial cytochrome oxidase Ⅱ gene among the orders of insects[J]. Mol Phylogene Evol，1992，1（1）：41-52.

從前面的分析來看，昆蟲的密碼子表現(xiàn)出明顯的A+T的含量偏向性，特別是在密碼子第3位，A+T含量很高，該位點的轉(zhuǎn)換較頻繁，并且堿基的替換也主要發(fā)生在第3位點上，但第3位點的轉(zhuǎn)換雖頻繁，卻很少會引起氨基酸的改變，因此將線粒體DNA CO Ⅰ全序列翻譯成氨基酸序列進行2次建樹。

在氨基酸序列NJ系統(tǒng)發(fā)育樹中，斑皮蠹屬、皮蠹屬、圓皮蠹屬分別聚為一支，明顯好于直接用CO Ⅰ序列構建的系統(tǒng)樹。將各發(fā)育樹進行比較發(fā)現(xiàn)結(jié)果基本一致，圓皮蠹屬均聚于最外緣（圖4）。

3 結(jié)論與討論

本研究通過下載整理皮蠹科30個分析對象的mtDNA CO Ⅰ序列并構建了不同分子系統(tǒng)發(fā)育樹，其結(jié)果在一定程度上反映了各屬之間的進化關系與親緣關系，秘魯皮蠹與斑皮蠹屬各分析對象之間的遺傳距離較近，與圓皮蠹屬的遺傳距離相對較遠，斑皮蠹屬較圓皮蠹屬進化速率快。當利用CO Ⅰ基因建樹后結(jié)果不很理想時，可將mtDNA中CO Ⅰ全序列翻譯成氨基酸序列進行2次建樹再次分析，以達到較好結(jié)果。另外，從形態(tài)學來看，地毯圓皮蠹復眼內(nèi)緣凹入，鞘翅具3條狹窄的白色橫帶，翅上以黑色鱗片居多，沿翅縫兩側(cè)尚有紅色鱗片形成的縱帶。而小圓皮蠹復眼內(nèi)緣不凹入，鞘翅上有3條由黃色及白色鱗片構成的波狀橫帶，體背面密生長三角形端部鈍的鱗片，二者雖同屬，卻差別明顯，系統(tǒng)進化樹同樣也驗證了這點，兩者的遺傳距離為0.737（>0.02），達到分子水平不同種的鑒定要求。

目前，NCBI上公布的皮蠹科昆蟲mtDNA CO Ⅰ基因較少，雖然本研究涉及的皮蠹種類不多，但其研究結(jié)果在一定程度上說明了mtDNA CO Ⅰ基因作為遺傳標記應用于皮蠹科系統(tǒng)分類研究是可行的方法之一。在下一步的研究中可增加標本的數(shù)量，以增強分類單元的代表性，通過研究mtDNA CO Ⅰ基因全序列以及其他分子標記基因，使其包含更多的信息量，為皮蠹科不同階元的分類提供更多的分子生物學證據(jù)。

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[4]王銀竹，余道堅，張潤杰，等. 基于mtDNA CO Ⅰ基因的十種長小蠹分子系統(tǒng)進化研究[J]. 昆蟲學報，2010，53（4）：457-463.

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[6]Liu H，Beckenbach A T.Evolution of mitochondrial cytochrome oxidase Ⅱ gene among the orders of insects[J]. Mol Phylogene Evol，1992，1（1）：41-52.