王水蓮，馮建忠，李文平，夏迪，盧向陽*，楊利國

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，湖南 長沙 410128；2.天津市中意畜牧科技有限公司，天津 300457；3.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖北 武漢 430070)

抑制素(INH)是由卵巢分泌的糖蛋白質(zhì)激素，能抑制垂體促卵泡素(FSH)的分泌。用INH 免疫奶牛能進(jìn)一步提高超排效果，且能增加胚胎數(shù)，提高胚胎質(zhì)量[1–2]。抑制素基因疫苗因其制備簡單、構(gòu)建成本低、純度高而受到關(guān)注。研究表明，單拷貝抑制素基因疫苗[3–6]和雙拷貝抑制素基因疫苗[7–8]均可誘導(dǎo)小鼠[3]、大鼠[4–8]、綿羊[9–10]、黃牛[11–12]產(chǎn)生抗抑制素抗體，同時(shí)提高FSH 分泌水平，促進(jìn)卵泡發(fā)育。但是目前尚缺少抑制素基因疫苗對子宮發(fā)育狀況方面的研究。

以上提到的單拷貝、雙拷貝抑制素基因疫苗，其抑制素基因均構(gòu)建在含抗性標(biāo)記的質(zhì)粒PGISI 上，而有抗性標(biāo)記的疫苗在實(shí)際生產(chǎn)中無法推廣應(yīng)用。韓麗等[13]利用“asd–減毒沙門氏菌–宿主平衡致死系統(tǒng)”構(gòu)建了無抗生素篩選的抑制素重組菌C500(PXAIS)基因疫苗，該疫苗以豬霍亂沙門氏菌弱毒株C500 為載體傳遞抑制素基因疫苗。將C500(pXAIS)重組菌以1010CFU/mL 的劑量免疫小鼠后，可顯著提高抗小鼠抑制素抗體水平，明顯增強(qiáng)小鼠的免疫效果[13]。本研究用C500(PXAIS)免疫產(chǎn)后奶牛，以探討抑制素基因疫苗對奶牛產(chǎn)后子宮復(fù)舊的影響，為抑制素基因疫苗應(yīng)用于奶牛生產(chǎn)提供參考數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 供試菌株

C500(pXAIS)重組菌[13]由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)楊利國教授贈送。

1.1.2 供試奶牛

從湖南省畜牧獸醫(yī)研究所奶牛場選擇胎次為2～4胎、健康無疾病的24 頭中國荷斯坦奶牛用于試驗(yàn)。

1.2 方 法

1.2.1 疫苗的制備

將重組菌C500(pXAIS)接種于LB 液體培養(yǎng)基，37 ℃振搖培養(yǎng)至菌液OD600nm=0.3～0.4，1 500×g 離心10 min 收集細(xì)菌，用滅菌PBS 調(diào)整細(xì)菌濃度至1010、109、108CFU/mL。

1.2.2 試驗(yàn)分組及免疫

依據(jù)年齡、胎次、產(chǎn)奶量、體重、膘情，將供試奶牛隨機(jī)分為4 組：高劑量免疫組(T1)、中劑量免疫組(T2)、低劑量免疫組(T3)和對照組(CK)，每組6 頭奶牛。高、中、低劑量免疫組奶牛在產(chǎn)后第7天按3 種劑量進(jìn)行初次免疫，即分別肌肉注射1010、109、108CFU/mL 重組菌C500(pXAIS)，每頭注射3 mL；對照組奶牛分別注射3 mL 10%生理鹽水。初次免疫后間隔28 d，用同等劑量疫苗對各組加強(qiáng)免疫1 次。

1.2.3 血樣檢測

分別在初次免疫后14、28 d，加強(qiáng)免疫后14、28 d，用真空采血管采集奶牛尾中動脈血樣約5 mL，3 500×g 離心10 min，分離血清，–20 ℃保存。用ELISA 方法檢測奶牛血清中抗抑制素抗體效價(jià)，以人工合成的抑制素融合蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)包被抗原進(jìn)行包被，血樣稀釋80 倍，以P/N 值＞2 判為陽性(其中P 為待測血樣的吸光值，N 為陰性對照血樣吸光值)[14]。

1.2.4 子宮觀察

從產(chǎn)后第7 天開始，用B 型獸用超聲掃描儀(DP–3300vet 全數(shù)字便攜式超聲診斷機(jī)，Mindary 公司)檢測產(chǎn)后奶牛子宮孕角和子宮頸的復(fù)舊情況，每3 d 檢測1 次，直到子宮完全恢復(fù)(產(chǎn)后子宮頸和子宮孕角直徑恢復(fù)到與未孕子宮相似時(shí)可認(rèn)為子宮完全恢復(fù))[15]。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)分析

抗體P/N 值、子宮頸和子宮孕角直徑用“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，用SPSS18.0 統(tǒng)計(jì)軟件對各項(xiàng)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 非抗性篩選抑制素基因疫苗免疫對奶?？挂种扑乜贵w水平的影響

由表1 可知，各免疫組奶牛的抗抑制素抗體的P/N 值均高于對照組，且高、中劑量免疫組奶牛的抗體P/N 值顯著高于對照組奶牛的抗體P/N 值(P＜0.05)；高劑量免疫組(T1)奶牛的抗抑制素抗體P/N 在初次免疫和加強(qiáng)免疫后均為最高，而低劑量免疫組(T3)奶牛的抗體P/N 在初次免疫和加強(qiáng)免疫后均為最低；且T1組與T3組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。與初次免疫期相比較，各免疫組在加強(qiáng)免疫后第14 d 的抗體P/N 值均提高，且P/N 值的變化規(guī)律一致，即在第一次免疫后不斷上升，在加強(qiáng)免疫第14 天達(dá)高峰。加強(qiáng)免疫后，各免疫組抗抑制素抗體陽性率均上升，其中加強(qiáng)免疫第14 天時(shí)T1組達(dá)83.33%(表2)。以上結(jié)果說明，在本試驗(yàn)條件下，抑制素基因疫苗(C500(pXAIS))免疫奶?？烧T導(dǎo)產(chǎn)生抗抑制素抗體，且高劑量免疫組的免疫效果最佳。

表1 抑制素基因疫苗(C500(pXAIS))免疫對奶?？挂种扑乜贵wP/N 值的影響Table 1 Effect of inhibin gene vaccine (C500(pXAIS)) immunization on P/N value of inhibin antibody of the dairy cows

表2 雙拷貝抑制素基因疫苗(C500(pXAIS))免疫對奶?？贵w陽性率的影響Table 2 Percentage of dairy cows with positive anti-inhibin antibody at different days after immunization of (C500(pXAIS))

2.2 非抗性篩選抑制素基因疫苗免疫對奶牛產(chǎn)后子宮復(fù)舊的影響

B 超檢測結(jié)果表明，高、中、低劑量免疫組奶牛產(chǎn)后至子宮頸恢復(fù)的間隔時(shí)間均短于對照組，但差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；產(chǎn)后至子宮孕角恢復(fù)的間隔時(shí)間均短于對照組，且高劑量免疫組與對照組之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05) (表3)。奶牛免疫抑制素基因疫苗后30 d 內(nèi)，子宮頸直徑逐漸變短，趨向于恢復(fù)正常大小，在前21 d 子宮頸恢復(fù)快，后7 d 恢復(fù)減弱(圖1)；子宮孕角直徑逐漸變短，趨向于恢復(fù)正常大小(圖2)，在前21 d 產(chǎn)后子宮孕角恢復(fù)較快，后7 d 恢復(fù)較慢(圖3)。

表3 不同劑量免疫組奶牛產(chǎn)后子宮頸及子宮孕角恢復(fù)間隔時(shí)間Table 3 Interval days of uterine cervix and uterine graivid horn recovery in postpartum dairy cows immunized with different doses of vaccine

圖1 不同劑量組奶牛產(chǎn)后子宮頸的變化Fig.1 Diameter changes of uterine cervix in different dosage groups of postpartum dairy cows

圖2 B 超顯示的子宮孕角變化Fig.2 Uterine gravid horms by type-B ultrasonic examination

圖3 不同劑量免疫組奶牛產(chǎn)后子宮孕角直徑的變化Fig. 3 Diameter changes of uterine gravid horn in different dosage groups of the postpartum dairy cows

3 討 論

本試驗(yàn)結(jié)果中，按3 個(gè)不同劑量(1010、109、108CFU/mL)分別對產(chǎn)后奶牛肌肉注射C500(pXAIS)重組菌3 mL 后，3 個(gè)免疫組奶?？挂种扑乜贵w水平均上升，加強(qiáng)免疫后高劑量免疫組(1010CFU/mL)的抗抑制素抗體陽性牛比例達(dá)83.33%(5/6)，表明C500(pXAIS)抑制素基因疫苗對奶牛有很好的免疫原性。隨著免疫劑量的增加，奶牛免疫應(yīng)答效果增強(qiáng)，呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系。 Liang 等[16]用低、中和高劑量生長抑制素基因疫苗免疫動物，中劑量基因疫苗的免疫應(yīng)答效果最好，這可能是由于核酸疫苗的免疫劑量不僅受免疫途徑和方法、質(zhì)粒的大小的影響，還受局部細(xì)胞攝取DNA 能力、質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率和抗原提呈效率等因素的影響[17]。本研究結(jié)果表明，抑制素基因疫苗免疫能誘導(dǎo)產(chǎn)后奶牛產(chǎn)生免疫應(yīng)答，但影響其免疫效果的因素(免疫劑量、免疫方式及加強(qiáng)免疫次數(shù)等)還需進(jìn)一步分析。

延長奶牛產(chǎn)后開放期將會導(dǎo)致奶牛場巨大經(jīng)濟(jì)損失，因此，奶牛產(chǎn)后子宮復(fù)舊和卵巢功能恢復(fù)對確保產(chǎn)后奶牛再次受孕及縮短產(chǎn)犢間隔時(shí)間非常重要。本研究結(jié)果顯示，高劑量(1010CFU/mL)重組菌(C500–pXAIS)基因免疫可顯著減少奶牛產(chǎn)后子宮孕角的恢復(fù)時(shí)間，這可能是高劑量基因疫苗免疫引起的較高免疫應(yīng)答促進(jìn)機(jī)體子宮組織結(jié)構(gòu)恢復(fù)的結(jié)果。

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