王興平，羅仍卓么，歐陽助姣，李峰，李娜，王京仁

(1.湖南文理學院生命科學學院，湖南 常德 415000；2.湖南省高校動物學重點實驗室，湖南 常德 415000)

湘西黃牛是湖南省優(yōu)秀的地方家畜品種，主產(chǎn)于湖南省湘西北地區(qū)，耐粗飼，耐熱，其肉質(zhì)富含蛋白質(zhì)和必需氨基酸，脂肪含量適宜，營養(yǎng)全面[1–3]。但是，湘西黃牛體型較小，生長發(fā)育緩慢，產(chǎn)肉率較低，嚴重制約了湘西黃牛產(chǎn)業(yè)的經(jīng)濟效益。為提高湘西黃牛生長發(fā)育速度和產(chǎn)肉率，同時保持其優(yōu)良肉質(zhì)，國內(nèi)研究者已經(jīng)對湘西黃牛的微衛(wèi)星多態(tài)性[4–5]和MC3R[6]、SST[7]、H–FABP[8]、LPL[9–11]等功能基因的多態(tài)性與生長性能的關聯(lián)進行了探索，結(jié)果表明，上述基因的部分多態(tài)性位點與湘西黃牛的生長性狀相關。但是，這些位點還不足以進行分子育種，更多的標記位點有待于進一步挖掘。

胰島素樣生長因子I 受體(IGF–IR)是胰島素樣因子家族(IGFs)的重要受體，通過與IGF–I 結(jié)合，共同介導生長激素(GH)的促生長信號通路，在哺乳動物細胞分化與增殖、胚胎發(fā)育、神經(jīng)發(fā)育、骨骼肌和骨骼發(fā)育等過程中起著重要的調(diào)節(jié)作用[12–16]。迄今為止，未見湘西黃牛IGF–IR 基因分子遺傳特征與生長性狀相關的研究報道。本試驗采用PCR 擴增及PCR–RFLP 技術，分析了IGF–IR 基因在湘西黃牛群體中的遺傳變異及分子遺傳特征，并對多態(tài)位點與湘西黃牛的生長性狀進行了關聯(lián)分析，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 供試牛

在湖南省常德地區(qū)隨機選擇205 頭湘西黃牛母牛，經(jīng)頸靜脈采集每頭牛的血液，并對牛進行口齒年齡鑒定和生長性狀指標(體重、體高、體斜長和胸圍)的測定。

1.1.2 試 劑

Taq DNA聚合酶、Taq I限制性內(nèi)切酶購自寶生物工程(大連)有限公司； DNA快速純化試劑盒、dNTP混合物、DNA Marker II購自天根生化科技(北京)有限公司；100 bp ladder plus Marker購自北京博凌科為生物科技有限公司。

1.1.3 引 物

引物(F:CCCA ATGGATTGATCCTCATGT；R: GCTGTGTAGTTCCC TGGGTT)[12,17–19]，用于擴增IGF–IR基因序列，包括12號外顯子(exon12)部分序列、12號內(nèi)含子(intron12)全序列及13號外顯子(exon13)部分序列預期擴增長度為616 bp。

1.2 方 法

1.2.1 基因組DNA 提取

頸靜脈采集2 mL湘西黃牛血液，離心，收集細胞，加血樣裂解液、SDS和蛋白酶K共計1 mL以裂解細胞，并采用等體積的酚/仿抽提?；蚪MDNA[20]，TE緩沖液溶解，0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測基因組DNA的純度，–20 ℃保存，備用。

1.2.2 PCR 擴增

用205頭湘西黃牛樣本的DNA為模板分別進行PCR擴增。PCR反應體系(20 μL)為：10×Buffer(含Mg2+) 2.0 μL，10 μmol/L上、下游引物各0.5 μL，10 μmol/L dNTPs 0.5 μL，2 U/μL Taq DNA聚合酶0.3 μL，DNA 1 μL，超純水15.2 μL。PCR反應條件為：95 ℃預變性5 min；35個循環(huán)(94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s)；終延伸10 min。產(chǎn)物經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測后分別用DNA快速純化試劑盒純化。

1.2.3 SNP 篩查

隨機挑選4頭湘西黃牛的PCR產(chǎn)物純化樣品，送生工生物工程(上海)有限公司進行測序，其序列與已公布的安格斯牛IGF–IR基因序列(GenBank登錄號為JQ924783)進行多序列比對，確定湘西黃牛SNP數(shù)目、突變類型及SNP的位置。將獲得的SNP與現(xiàn)有文獻資料和SNP數(shù)據(jù)庫進行比較，以確定湘西黃牛IGF–IR基因的新SNP。

1.2.4 RFLP 與基因分型

根據(jù)SNP酶切位點的分析結(jié)果，確定基因分型位點及RFLP分析用限制性內(nèi)切酶，對純化后的PCR產(chǎn)物進行酶切。酶切體系為：PCR純化產(chǎn)物3 μL，10×限制性內(nèi)切酶Buffer 1 μL，0.1% BSA 1 μL，限制性內(nèi)切酶0.5 μL，滅菌雙蒸水4.5 μL，65 ℃水浴8～10 h。酶切產(chǎn)物用4%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)拍照。根據(jù)條帶初步判斷基因型，并以初步判斷的純合子個體的基因組DNA為模板分別進行PCR(反應條件同上)。PCR產(chǎn)物純化后送生工生物工程(上海)有限公司測序，驗證基因分型的準確性。

1.2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

用POPGENE1.31軟件對基因頻率和基因型頻率、多態(tài)信息含量、群體雜合度、有效等位基因數(shù)和Hardy–Weinberg平衡χ2檢驗進行統(tǒng)計。根據(jù)影響牛生長性狀的因素，在對基因型與表型性狀的關聯(lián)分析時采用了固定模型：Trait(生長性狀)=μ(均值)+A(年齡)+G(基因型)+e(隨機殘差)，運用SAS (Statistical analysis system) 8.2 軟件GLM程序，分析標記基因型對生長性狀的影響，并采用文獻[21]的方法估計基因效應。

2 結(jié)果與分析

2.1 IGF–IR 基因的擴增結(jié)果

PCR產(chǎn)物的電泳結(jié)果如圖1所示。結(jié)合測序結(jié)果可知，PCR擴增產(chǎn)物長度為616 bp，其在IGF–IR基因序列(GenBank登錄號為JQ924783)中的位置為第95～710 bp。

圖1 湘西黃牛IGF–IR基因的PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果Fig.1 Electrophoresis patterns of PCR product for IGF–IR gene in Xiangxi cattle

2.2 IGF–IR 基因SNP 分析結(jié)果

多重比對結(jié)果表明，湘西黃牛IGF–IR基因部分序列中存在34個SNPs(表1)，其中32個SNPs位于intron 12，2個SNPs位于exon 13；插入突變2個，缺失突變2個，轉(zhuǎn)換突變23個，顛換突變7個；exon 13中的2個SNPs(g.659 C＞T和g.668 T＞C)均屬于酪氨酸的同義突變。34個SNPs中，除了g.551G＞T位點有文獻[12,17–19]報道外，其余33個SNPs均未見相關文獻報道，也未有在SNP數(shù)據(jù)庫中收錄。

表1 湘西黃牛IGF–IR基因SNP篩查結(jié)果Table 1 SNPs identified within IGF–IR gene in Xiangxi cattle

2.3 IGF–IR 基因g.551G>T 位點的RFLP 基因分型

在上述34個SNPs中，僅有g.551G＞T位點能被Taq I內(nèi)切酶所識別，且在其他牛品種上有相關的文獻報道[12,17–19]。為了能夠與其他牛品種群體遺傳多態(tài)性進行比較，揭示湘西黃牛群體遺傳特征，本研究選擇g.551G＞T位點進行群體遺傳多態(tài)性分析。

PCR產(chǎn)物的TaqI內(nèi)切酶(識別T?CGA序列)酶切產(chǎn)物的結(jié)果(圖2)顯示，該位點在湘西黃牛群體中共出現(xiàn)3種基因型，分別為AA型(569、47 bp)，AB型(569、408、161、47 bp)和BB型(408、161、47 bp)。純合子基因型測序結(jié)果(圖3)表明，3種基因型的PCR產(chǎn)物的47～50 bp處均存在Taq I限制性內(nèi)切酶識別位點。

圖2 酶切產(chǎn)物的電泳結(jié)果Fig. 2 Electrophoresis and genotyping for PCR product digested by Taq I

圖3 純合子個體的PCR 產(chǎn)物測序結(jié)果Fig. 3 Sequecing results of PCR products from individuals with IGF–IR genotype AA and BB

2.4 IGF–IR 基因g.551G>T 位點的群體遺傳特征

IGF–IR 基因g.551G＞T 位點的群體遺傳特征統(tǒng)計結(jié)果見表2。3 種基因型分布頻率的高低順序為AB、AA、BB。A 為優(yōu)勢等位基因。多態(tài)信息含量為0.363 7(介于0.25～0.50)。從雜合度和有效等位基因數(shù)可看出，g.551G＞T 位點在湘西黃牛群體中處于中度多態(tài)性，并且已經(jīng)達到了Hardy–Weinberg 平衡狀態(tài)(P＞0.05)。

表2 湘西黃牛IGF–IR 基因g.551G>T 位點的群體遺傳特征Table 2 The population genetic characters of g.551G>T locus in IGF–IR gene in Xiangxi cattle

2.5 IGF–IR 基因g.551G>T 位點多態(tài)性與生長性狀的關聯(lián)分析

差異顯著性檢驗結(jié)果(表3)表明，湘西黃牛3種基因型個體的體高、體長、胸圍和體重差異均不顯著(P>0.05)。等位基因效應結(jié)果(表4)表明，A 等位基因?qū)ο嫖鼽S牛的體高、體長、胸圍和體重4 個性狀均為正效應，而B 等位基因均為負效應。綜上結(jié)果可知，A 等位基因雖然對生長性狀均有正效應，但其影響均不顯著，因此，從生物統(tǒng)計的角度判斷，g.551G＞T 位點不適合作為湘西黃牛生長性狀的分子標記位點。

表3 IGF–IR 基因g.551G>T 位點不同基因型及等位基因?qū)ο嫖鼽S牛生長性狀的影響Table 3 The effects of g.551G>T locus in IGF–IR gene on growth traits in Xiangxi cattle

表4 IGF–IR 基因g.551G>T 位點對湘西黃牛生長性狀的等位基因效應Table 4 The Effective of different alleles of g.551G>T locus in IGF–IR gene on growth traits in Xiangxi cattle

3 討 論

本試驗用文獻[12,17–19]中的引物擴增了湘西黃牛的IGF–IR基因部分序列，長度為616 bp，與GenBank 中收錄的安格斯牛的序列長度相同(JQ92478)。但是用同樣的引物從郟縣紅牛、秦川牛、南陽牛、安格斯、荷斯坦牛、西門塔爾雜交牛、安格斯雜交牛和Najdi牛中擴增出的PCR產(chǎn)物長度均為625 bp[12,17–19]。

迄今為止，SNP數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.nih. gov/snp/?term=IGF1R+bos)收錄了2 233個牛IGF–IR基因的SNPs，可見牛IGF–IR基因具有豐富的遺傳多態(tài)性。本試驗所檢測到的34個SNPs均未包含在該數(shù)據(jù)庫中，而僅有g.551G＞T有相關文獻[12,17–19]報道。說明除了g.551G＞T之外的33個SNPs均為筆者新發(fā)現(xiàn)的SNPs，該結(jié)果也說明湘西黃牛群體中IGF–IR基因具有豐富的遺傳多態(tài)性，可作為揭示湘西黃牛群體遺傳特征的候選基因。

本試驗PCR–RFLP的結(jié)果表明，湘西黃牛與其他牛[12,17–19]IGF–IR基因g.551G＞T位點的群體遺傳多態(tài)性有以下差異：①酶切片段長度有差異。湘西黃牛在該位點存在3種基因型：AA型(569、47 bp)，AB型(569、408、161、47 bp)和BB型(410、170、47 bp)，而郟縣紅牛、秦川牛和南陽牛等品種[12,17–19]中的3種基因型則分別為AA型(580、45 bp)，AB型(580、410、170、45 bp)和BB型(410、170、45 bp)，這種差異是由IGF–IR基因序列長度差異所造成的。②基因型分布頻率與部分牛品種有差異。湘西黃牛3種基因型分布頻率的高低順序為AB、AA、BB，與Curi等[17]報道的基因型分布的趨勢相同，而Zhang等[18]報道郟縣紅牛、秦川牛和南陽牛群體中3種基因型分布頻率的高低順序為AA、AB、BB，其中BB型個體數(shù)量很少。經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)，湘西黃牛AA和AB的基因型頻率與上述?；蛐皖l率分布存在顯著差異(P＜0.05)，而BB基因型頻率分布差異不顯著(P＞0.05)。③等位基因頻率分布有差異。湘西黃牛A和B等位基因的頻率分別為0.609和0.3902。經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)，湘西黃牛與Nellore、Canchim牛群體[17]的A和B基因頻率分布沒有顯著差異(P＞0.05)，而與西門塔爾雜交牛和安格斯雜交牛[17]、郟縣紅牛、秦川牛和南陽牛[18]、荷斯坦牛和Najdi牛[19]群體的A和B基因頻率分布存在顯著差異(P＜0.05)。群體遺傳特征表明，湘西黃牛群體的IGF–IR基因g.551G＞T位點處于中度多態(tài)，且在群體中達到了Hardy–Weinberg平衡狀態(tài)(P＞0.05)，說明該位點不適合用于分子標記輔助育種。 研究 表明，1周歲牦牛IGF–IR基因exon 1的SSCP多態(tài)位點的EE型個體的胸圍、體斜長、體重等顯著高于EF和FF型個體(P＜0.05)，而對于成年牦牛沒有影響。Szewczuk等[23]研究表明，牛IGF–IR基因rs41640706/MspI位點(A/G)的GG型個體的斷奶重顯著高于AG型個體(+5.06 kg)。對于IGF–IR基因g.551G＞T位點而言，該位點的RFLP/TaqI不同基因型對南陽牛生長性狀影響不顯著[12]。上述文獻結(jié)果顯示，IGF–IR基因多態(tài)性對不同牛品種(或在同一品種的不同發(fā)育階段)生長性狀的影響效果不同。為了進一步確定IGF–IR基因多態(tài)性對湘西黃牛生長性狀的關系，筆者進行了g.551G＞T位點的關聯(lián)分析，結(jié)果表明，g.551G＞T位點的多態(tài)性對湘西黃牛群體的體高、體長、胸圍和體重均無顯著影響(P＞0.05)，表明g.551G＞T位點可能與湘西黃牛的生長性狀QTL沒有連鎖關系，不適合作為湘西黃牛生長性狀的分子標記位點。

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