牛麗，曹佩琴，劉仲華

(1.國(guó)家植物功能成分利用工程技術(shù)研究中心，湖南 長(zhǎng)沙410128；2.湖南省植物功能成分利用協(xié)同創(chuàng)新中心，湖南 長(zhǎng)沙410128；3.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)茶學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙410128)

一氧化氮(NO)是一種極不穩(wěn)定的氣體分子，帶有自由基，能溶于組織并且能自由地穿過(guò)細(xì)胞膜，可以引起細(xì)胞核酸亞硝?；茐腄NA 的螺旋結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致細(xì)胞受損[1]。NO 還可以破壞細(xì)胞的呼吸鏈，大量消耗三磷酸酰苷(ATP)，對(duì)細(xì)胞造成毒性損傷，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[2–3]。一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS) 是誘導(dǎo)合成NO 的關(guān)鍵酶，一旦被誘導(dǎo)，即可大量合成NO，活性可持續(xù)長(zhǎng)達(dá)20 h[4]。

茶黃素是一類(lèi)多酚羥基具苯駢酚酮結(jié)構(gòu)的物質(zhì)，是存在于紅茶中的一種金黃色色素。在紅茶中含量一般為0.3%～1.5%。研究表明，茶黃素有抗氧化、防治心血管疾病、降血脂、抗癌、防癌等功效[5]。茶黃素–3,3'–雙沒(méi)食子酸酯(TFDG)是茶黃素4 種主要的單體物質(zhì)之一，具有較多的酚羥基，有較強(qiáng)的抗氧化活性。

隨著人們生活水平的提高，糖尿病發(fā)病率迅猛增長(zhǎng)，其并發(fā)癥糖尿病性白內(nèi)障(diabetic cataract，DC)也成為全球眼病致盲的主要原因。有研究表明，氧化應(yīng)激是誘導(dǎo)糖尿病性白內(nèi)障發(fā)病的主要機(jī)制之一[6–7]。本研究中，筆者采用高濃度葡萄糖對(duì)人晶狀體上皮細(xì)胞(HLECs)造成氧化損傷，再用不同濃度的茶黃素單體物質(zhì)TFDG 進(jìn)行干預(yù)，探討TFDG 對(duì)HLECs 的保護(hù)作用，旨在為治療白內(nèi)障疾病提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試細(xì)胞

人晶狀體上皮細(xì)胞SRA01/04(HLECs SRA01/ 04)購(gòu)自徐州醫(yī)學(xué)院。

1.2 主要試劑和儀器

TFGD(北京工商大學(xué)植物資源研究開(kāi)發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室)；MEM 培養(yǎng)基(Cyclone)；胎牛血清(FBS，美國(guó)Gibco)；PBS 粉劑(美國(guó)Amresco 公司)；胰蛋白酶(美國(guó)Gibco 公司)；二甲基亞砜(DMSO，美國(guó)Gibco 公司)；NOS 和NO 檢測(cè)試劑盒(南京建成生物工程研究所)；VC–50 超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)(美國(guó)SONICS 公司)；2111 型二氧化碳培養(yǎng)箱(美國(guó)FORMA 公司)。

1.3 細(xì)胞的正常培養(yǎng)

HLECs 細(xì)胞置于37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)基為含10%FBS 的MEM，待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%匯合度時(shí)用胰酶消化，按1∶4 的比例傳代。

1.4 HLECs 損傷模型細(xì)胞的誘導(dǎo)

將細(xì)胞傳代后，調(diào)整細(xì)胞密度至2×104個(gè)/mL，接種于96 孔板，正常培養(yǎng)24 h 后，棄培養(yǎng)液，加入葡萄糖濃度為0、10、20、30、40、50、60、70、80 mmol/L 的MEM 培養(yǎng)基150 μL，每個(gè)濃度設(shè)6個(gè)重復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)24 h 后，每孔加入20 μL 的MTT 溶液，孵育4 h。棄培養(yǎng)基，加入150 μL DMSO，置搖床上低速振蕩10 min。在酶標(biāo)儀紫外波長(zhǎng)490 nm處檢測(cè)吸光值，計(jì)算細(xì)胞的存活率，根據(jù)Li 等[8]和Jain 等[9]的研究結(jié)果確定葡萄糖造模濃度。

1.5 TFDG 對(duì)高糖誘導(dǎo)的HLECs 損傷的影響

HLECs 細(xì)胞用96 孔板培養(yǎng)后，根據(jù)以上確定的葡萄糖造模濃度，加入葡萄糖，培養(yǎng)24 h，棄舊培養(yǎng)液，往各孔分別加入TFDG 濃度為4、8、16、32、64、128、256、512 μ mol/L 的MEM 培養(yǎng)基150 μL，每個(gè)濃度設(shè)6 個(gè)重復(fù)孔，孵育24 h。MTT 檢測(cè)細(xì)胞的活力，與正常培養(yǎng)細(xì)胞(CK)和未經(jīng)TFDG處理的損傷模型細(xì)胞(HG Model)比較存活率。

1.6 HLECs 內(nèi)NOS 活性和NO 含量的測(cè)定

按照上述方法培養(yǎng)正常細(xì)胞、損傷模型細(xì)胞及TFDG 處理的損傷模型細(xì)胞，收集細(xì)胞，制成1 mL PBS 懸液。將細(xì)胞懸液進(jìn)行超聲破碎，4 000 r/min 離心10 min。取上清，分別按NOS 檢測(cè)試劑盒(化學(xué)比色法)和NO 檢測(cè)試劑盒(硝酸還原酶法)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，計(jì)算出HLECs 內(nèi)NOS 活性和NO 含量。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

用SPSS17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量數(shù)據(jù)以“均數(shù)± 標(biāo)準(zhǔn)差進(jìn)行描述；多組間比較采用單因素ANOVA方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 構(gòu)建HLECs 損傷模型的葡萄糖濃度及處理時(shí)間的確定

MTT比色法檢測(cè)結(jié)果(圖1)顯示，低濃度的葡萄糖刺激細(xì)胞的增長(zhǎng)，當(dāng)葡萄糖濃度為30 mmol/L時(shí)，作用24 h，細(xì)胞活力最大。用50 mmol/L葡萄糖處理24 h的細(xì)胞，其存活率為67.6%，初步選擇此葡萄糖濃度和處理時(shí)間為造模條件。對(duì)此條件處理的細(xì)胞進(jìn)行光學(xué)顯微鏡觀察(圖2)，可見(jiàn)細(xì)胞多呈圓形，出現(xiàn)大量漂浮細(xì)胞，并伴有部分細(xì)胞碎片，而正常培養(yǎng)細(xì)胞呈多角形或六邊形，因此，確定HLECs損傷造模用葡萄糖濃度為50 mmol/L，處理時(shí)間為24 h。

圖1 葡萄糖濃度和處理時(shí)間對(duì)HLECs 的存活率的影響Fig. 1 Effect of different concentration of HG and treating time on survival rate of HLECs

圖2 倒置顯微鏡下細(xì)胞的形態(tài)(10×)Fig. 2 HLEC cells under inverted microscope

2.2 不同濃度TFDG 對(duì)HG 誘導(dǎo)的HLECs 損傷細(xì)胞的存活率的影響

HLECs損傷模型細(xì)胞經(jīng)濃度為4～512 μmol/L的TFDG處理24 h后，進(jìn)行MTT比色法檢測(cè)的結(jié)果(圖3) 顯示，當(dāng)TFDG濃度為8～32 μmol/L時(shí)，損傷細(xì)胞存活率隨濃度的升高而增加，與未用TFDG處理的模型細(xì)胞相比，存活率顯著提高(P＜0.05)；當(dāng)TFDG濃度為64～512 μmol/L時(shí)，損傷細(xì)胞的存活率隨著濃度的升高而降低；當(dāng)TFDG濃度為512 μmol/L時(shí)，細(xì)胞幾乎全部死亡。

圖3 不同濃度TFDG 處理下HLEC 模型細(xì)胞的存活率(作用 24 h)Fig. 3 Effect of different concentration of TFDG (24 h) on survival rate of model HLECs

2.3 不同濃度TFDG 處理下HLECs 損傷細(xì)胞內(nèi)NOS 的活性及NO 的含量

由表1可知，正常培養(yǎng)的HLEC細(xì)胞中，NOS有一定的活性。與正常培養(yǎng)細(xì)胞相比，在高濃度葡萄糖的誘導(dǎo)下，損傷模型細(xì)胞NOS的活性以及NO的含量都有一定的升高。加入不同濃度的TFDG以后，損傷模型細(xì)胞內(nèi)NOS的活性均顯著下降，NO的含量均顯著減少，其中32 μmol/L TFDG處理細(xì)胞的NOS活性及NO含量最低。

表1 不同濃度TFDG 對(duì)SRA01/04 細(xì)胞NOS 活性、NO含量的影響Table 1 Effects of different concentrations of TFDG on NOS activity and NO content of HLECs

3 結(jié)論與討論

大量試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，脊椎動(dòng)物的小梁網(wǎng)、睫狀肌、虹膜、脈絡(luò)膜、視網(wǎng)膜、LEC 等都有NOS 分布[10–12]。NOS 可催化氧分子和L–精氨酸反應(yīng)生成NO，少量NO 可以維持機(jī)體正常的生理需求，參與調(diào)節(jié)機(jī)體一系列生理活動(dòng)[12]，而大量的NO 會(huì)對(duì)組織細(xì)胞造成劇烈的氧化損傷。近年的研究發(fā)現(xiàn)，NO 與眼的生理和病理有密切關(guān)系，如參與眼壓的調(diào)節(jié)和眼部缺血損傷[13]、糖尿病視網(wǎng)膜病變的發(fā)生發(fā)展過(guò)程[14–15]等。有相關(guān)研究表明，NOS 誘發(fā)生成大量的NO，導(dǎo)致糖尿病機(jī)體被氧化損傷，并參與形成白內(nèi)障[16]。

本研究證實(shí)，正常HLECs 中存在NOS 和NO。HLECs 細(xì)胞經(jīng)高濃度葡萄糖誘導(dǎo)后，其細(xì)胞活力顯著下降，NOS 活性與NO 含量均上升，細(xì)胞出現(xiàn)明顯損傷。用32 μmol/L TFDG 處理后，損傷細(xì)胞的活力上升幅度最大，其細(xì)胞內(nèi)的NOS 活性及NO含量也下降最明顯，而過(guò)量的TFDG(64～512 μmol/L)處理?yè)p傷細(xì)胞后，反而導(dǎo)致其細(xì)胞活力下降，甚至死亡。本試驗(yàn)結(jié)果表明，適量的TFDG 能通過(guò)減弱NOS 的活性，降低NO 的合成，來(lái)對(duì)抗高濃度葡萄糖誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷。

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