劉秀斌，張瑩，曾建國，喬立瑞，黃靜，kate Yu

(1.湖南省檢驗檢疫科學(xué)技術(shù)研究院，湖南 長沙 410004；2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝園林學(xué)院，湖南 長沙 410128； 3.沃特世科技(上海)有限公司，上海 201206；4.沃特世科技有限公司，馬薩諸塞州，美國 01757)

銀杏葉為銀杏科植物銀杏(Ginkgo biloba L.)的葉。銀杏葉性味甘苦澀平，有益心斂肺、化濕止瀉、降低血黏度、清除自由基等功效，其主要化學(xué)成分為總黃酮醇苷與萜類內(nèi)酯類[1–3]。

周恩麗等[4]對不同生長時期銀杏葉中的總內(nèi)酯進行研究的結(jié)果表明，5月銀杏葉中的總內(nèi)酯含量最高，7月后呈下降趨勢。但無論是已報道的文獻還是中國藥典對銀杏葉的采集時間均沒有明確的說明與規(guī)定。不同采收期銀杏葉的化學(xué)成分的差異導(dǎo)致銀杏葉質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)難以控制。

以往對藥材質(zhì)量控制研究僅局限于某幾個特征成分，忽略了其他成分的變化，而代謝組學(xué)從植物生物體系的整體性和動態(tài)性出發(fā)，研究植物次生代謝產(chǎn)物在生命過程中的動態(tài)變化規(guī)律，可從整體上科學(xué)評價和控制不同生長時期藥材的質(zhì)量。 筆者基于UPLC–QTOF MSE的代謝組學(xué)研究方法，系統(tǒng)地分析不同采收期銀杏葉中化學(xué)成分的差異，確定銀杏葉的合適采收期，旨在為科學(xué)制定銀杏葉質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

銀杏葉采自湖南瀏陽于2003年種植的銀杏樹苗圃。于2010年5月1日到9月15日，每隔15 d采收1次樣品，得到10個不同生長時期的鮮銀杏葉樣品。

1.2 方 法

1.2.1 樣品處理

取新鮮銀杏葉，加入約5 倍水打漿后，在80℃下浸提2次 ，每次提取2 h，過濾得提取液。合并濾液，用殼聚糖澄清處理，加于已處理好的AB–8大孔吸附樹脂柱上，依次用5 倍柱體積水、4 倍柱體積70%乙醇洗脫，收集乙醇洗脫液，回收乙醇，濃縮成稠膏，真空干燥( 55 )℃，粉碎，得粉末狀樣品。將以上得到的粉末狀樣品溶解到甲醇與丙酮體積比為9∶1 的溶液中，其終質(zhì)量濃度為10mg/mL，然后稀釋10 倍量至 1mg/mL，準(zhǔn)備進樣。

1.2.2 樣品分析條件

色譜條件：采用Waters ACQUITY UPLC 系統(tǒng)進行液相分離。色譜柱的型號為ACQUITY UPLC HSS T3，1.7 μm，2.1 mm×100 mm；柱溫55℃；流動相A(0.1% Formic Acid Water)、B(MeOH)；流速為0.5mL/min；進樣量為5 μL；A 的洗脫梯度為75%～10% (1～16min), 16.1～17min 用100%B 沖洗色譜柱，17min 后返回初始濃度平衡色譜柱4min。

質(zhì)譜條件：采用Waters Xevo Q–TOF Mass Spectrometer、電噴霧離子源負(fù)離子模式；毛細管電壓3 kV；錐孔電壓40 V；離子源的溫度150℃；脫氣流速800 L/h；溫度550℃；數(shù)據(jù)采集模式為MSE，設(shè)定一低碰撞電壓 (Low CE)為5 eV，高碰撞電壓(High CE)為15～25 eV。采用亮氨酸腦非酞作為校正溶液，[M–H]–: 554.261 5。

1.2.3 數(shù)據(jù)分析

通過應(yīng)用軟件MarkerLynx V4.1 對質(zhì)譜數(shù)據(jù)進行分析。首先將三維的LC/MS 數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換成二維矩陣，將每一個數(shù)據(jù)點轉(zhuǎn)換成精確質(zhì)量和保留時間(EMRT)的數(shù)據(jù)對；再通過多元統(tǒng)計學(xué)分析中相關(guān)參數(shù)的設(shè)置，該變量表可以直接通過SMICA–P(V11.5)多元統(tǒng)計學(xué)分析軟件來分析，即可對A組內(nèi)所有樣品(A1～A10)進行統(tǒng)計學(xué)分析。分析參數(shù)設(shè)定為：保留時間1～18min；質(zhì)譜范圍50～1 500 amu；質(zhì)譜允許偏差0.05 amu；噪音消除水平6.0；強度閾值100；質(zhì)譜窗口0.05 amu；保留時間0.2min。

2 結(jié)果與分析

為了更有效地獲取銀杏葉中化合物的相關(guān)信息，需先進行色譜分離條件的系統(tǒng)優(yōu)化。本研究中通過對流動相進行細致的考察，實現(xiàn)了樣品中大量化合物的有效分離。從圖1 可以看出，銀杏樣品的組分極性范圍很寬，從高極性到低極性的化合物均能在總離子圖中有所體現(xiàn)，如在0～8min 主要集中的是極性大的組分；在12～18min 主要集中的是極性較小的部分。8～12min 期間組分峰較少，可能是由于該時間段內(nèi)化合物較少或組分離子化程度不高。

通過UPLC 串聯(lián)Q–TOF 的分析方法，并采用了MSE的采集模式，在一次進樣分析中，不僅能夠得到樣品中所有化合物的一級高分辨質(zhì)譜數(shù)據(jù)，同時也能夠得到對應(yīng)的二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)，其中一級高分辨質(zhì)譜數(shù)據(jù)能夠提供化合物的母離子信息，二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)提供相應(yīng)化合物的子離子的信息。該數(shù)據(jù)采集模式的高通量特性為后期的大量化合物數(shù)據(jù)的分析奠定基礎(chǔ)。

圖1 采用MSE 的采集模式同時得到的一級和二級質(zhì)譜圖 Fig.1 MS and MS/MS spectra obtained by MSE acquisition mode

通過上述方法得到含有三維信息(保留時間、質(zhì)荷比及響應(yīng)強度)的數(shù)據(jù)。每個三維數(shù)據(jù)信息代表一個化合物，共得到1 425個以二維矩陣型式(EMRT)列出的數(shù)據(jù)對。由于試驗得出的銀杏葉中化合物的信息量大，采用手動的數(shù)據(jù)分析方法工作量大、耗時長，因此，使用多元統(tǒng)計的主成分分析法(PCA)[5–7]對LC/MS 數(shù)據(jù)進行分析。

將上述1 425個數(shù)據(jù)對組成的變量表直接通過SMICA–P 多元統(tǒng)計學(xué)分析軟件完成不同生長時期內(nèi)所有樣品(A1～A10)的統(tǒng)計分析，如主成分分析(PCA)圖2–A 中所示：從春季到夏季再到秋季，其對應(yīng)的樣品成分隨著季節(jié)的不同有著明顯的變化規(guī)律，每個數(shù)據(jù)點代表一個樣品。通過PCA 的載荷圖(圖2–B)進一步分析造成樣品成分變化明顯的原因，該圖中的每個點代表上述1 425個EMRT 中的1個離子對，而每個區(qū)域的離子對信息與樣品所在的象限是一一對應(yīng)的。從載荷圖中可以看出，距離中心較遠的點是造成該季節(jié)樣品成分變化的主要貢獻者，如圖中紅框標(biāo)注的Markers 代表著引起秋季銀杏葉樣品與夏季、春季銀杏葉差異的標(biāo)志性化合物。同理，黃色框內(nèi)的代表著春季和秋季樣品里有顯著差異的Marker。

圖2 不同季節(jié)新鮮銀杏葉水提液的PCA 主成分分析圖(A)和載荷圖(B) Fig. 2 PCA score plot(A) and PCA Loading plot(B) of water extract of Fresh Ginkgo leaf in different seasons

為了深入研究春季與夏季、秋季銀杏葉樣品間 的組分差異，從圖3–A 可以明顯看到這些組分在春季的含量明顯高于其他時節(jié)，其中圖3–A 中藍色框內(nèi)保留時間為4.69min、m/z 為755.183 9 的這個潛在標(biāo)志物在銀杏葉中的含量從春季到夏季、秋季呈明顯的下降趨勢(圖3–B)。將這些春季含量高的特征標(biāo)記物(Marker)用Excel 文件保存下來(表1)。

圖3 載荷圖黃色框內(nèi)組分(A)和槲皮素對香豆?；咸烟鞘罄钐擒?B)在不同采收季節(jié)的含量變化趨勢 Fig.3 Change trends of the content of component in yellow box(A) and quercetin 3–O–2’’– (6’’’–p–coumaroyl)glucosylrhamnoside (B) in different harvest seasons

表 1 利用載荷圖中獲得區(qū)分春季和秋季樣品差異最高貢獻的12個精確質(zhì)量與保留時間的數(shù)據(jù)對列表 Table 1 List of the 12 quality precision data and retention time contributed highest to the difference that distinguish samples between spring and autumn using the load plot

為了對春季含量高的特征標(biāo)記物進行結(jié)構(gòu)解析，將表 1 中這些 EMRT 數(shù)據(jù)對重新輸入MarkerLynx 列表中，通過軟件中元素組成分析功能計算分子式以及搜索數(shù)據(jù)庫。以保留時間4.69min的這個化合物為例，說明潛在標(biāo)志物的結(jié)構(gòu)解析過程。[M–H]–精確分子量(m/z)為755.183 9，通過計算該化合物分子式為C36H35O18，利用MarkerLynx 軟件中自動搜索Chemispider 數(shù)據(jù)庫的功能及相關(guān)的文獻[8]報道，最終推測該化合物可能為槲皮素對香豆?；咸烟鞘罄钐擒铡８鶕?jù)該化合物的結(jié)構(gòu)特點以及二級碎片，軟件MassFragmentTM自動地對該化合物的裂解進行推測，如圖4 所示。

圖4 目標(biāo)化合物的結(jié)構(gòu)裂解推導(dǎo) Fig. 4 Fragmentation of the target compound structure

3 討 論

本試驗探索利用代謝組學(xué)技術(shù)實現(xiàn)對銀杏葉組分進行綜合性評價，作了一種有意義的嘗試。研究結(jié)果表明，在不同采收季節(jié)采集的銀杏葉組分差異明顯，并呈規(guī)律性的變化，槲皮素對香豆?；咸烟鞘罄钐擒盏赛S酮醇苷類成分含量從春季到夏季、秋季呈下降趨勢，尤其在春季采收與在秋季采收有明顯的不同，因此，應(yīng)建立規(guī)范合理的銀杏葉質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，采收銀杏葉應(yīng)有季節(jié)說明，并加強對上市產(chǎn)品的質(zhì)量監(jiān)控。該研究結(jié)果可以為后期深入研究銀杏葉質(zhì)量與科學(xué)的規(guī)定采收時節(jié)提供參考和借鑒，同時也為其他中藥材的質(zhì)量評價和控制提供了一種新的模式和手段。

感謝鄭亞杰博士在論文修改過程中提供的幫助。

[1] 孔繁莉．銀杏葉成分在臨床上的應(yīng)用[J]．吉林醫(yī)學(xué)，2010，31(12)：1688．

[2] Teris A B，Paola M．Chemical analysis and quality control of Ginkgo biloba leaves，extracts，and phytopharmaceu- ticals [J]．Jourrnal of Chromatography A，2009，1216：2002–2032．

[3] Tang Y P，Wang Y，Lou F C，et al．Flavonolglycosides from the leaves of Ginkgo biloba [J]．Acta Pharmaceutica Sinica，2000，35(5)：363–366．

[4] 周恩麗．樹齡、采收期和干燥方法對銀杏葉中總內(nèi)酯的影響[J]．現(xiàn)代藥物與臨床，2012，7(4)：380–382．

[5] 阿基業(yè)．代謝組學(xué)數(shù)據(jù)處理方法——主成分分析[J]．中國臨床藥理學(xué)與治療學(xué)，2010，15(5)：481–489．

[6] 王廣基，查偉斌，郝海平，等．代謝組學(xué)技術(shù)在中醫(yī)藥關(guān)鍵科學(xué)問題研究中的應(yīng)用前景分析[J]．中國天然藥物，2008，6(2)：89–97．

[7] 齊煉文，李萍，趙靜．代謝組學(xué)與中醫(yī)藥現(xiàn)代研究[J]．世界科學(xué)技術(shù)——中醫(yī)藥現(xiàn)代化，2006，8(6)：79–86．

[8] Tang Y，Lou F，Wang J，et al．Coumaroyl flavonolglycosides from the leaves of Ginkgo biloba[J]. Phytochemistry，2001，58(8)：1251–1256．