李國(guó)清，陳帥飛＊，劉菲菲，周旭東，謝耀堅(jiān)

(1. 國(guó)家林業(yè)局桉樹(shù)研究開(kāi)發(fā)中心，廣東 湛江 524022；2. 富優(yōu)基尼生物技術(shù)(上海)有限公司，上海 200235)

6種殺菌劑對(duì)不同桉樹(shù)焦枯病病原菌的室內(nèi)毒力測(cè)定

李國(guó)清1，陳帥飛1＊，劉菲菲1，周旭東2，謝耀堅(jiān)1

(1. 國(guó)家林業(yè)局桉樹(shù)研究開(kāi)發(fā)中心，廣東 湛江 524022；2. 富優(yōu)基尼生物技術(shù)(上海)有限公司，上海 200235)

由麗赤殼屬(Calonectria)真菌引起的桉樹(shù)焦枯病是桉樹(shù)世界范圍內(nèi)的重要病害之一。為了篩選能有效抑制麗赤殼屬病原菌的殺菌劑，本研究采用6種殺菌劑(百菌清、代森錳鋅、多菌靈、甲基硫菌靈、嘧菌酯、咪鮮胺)對(duì)5種桉樹(shù)麗赤殼屬病原菌(Ca. cerciana、Ca. crousiana、Ca. fujianensis、Ca. pauciramosa、Ca. pseudoreteaudii)通過(guò)菌絲生長(zhǎng)法測(cè)定其室內(nèi)毒力強(qiáng)弱。結(jié)果顯示：6種殺菌劑對(duì)5種麗赤殼屬病原菌均有一定的抑制作用，且差異顯著。不同殺菌劑對(duì)同一麗赤殼屬病原菌的抑制效果差異顯著，不同麗赤殼屬病原菌對(duì)同一殺菌劑的敏感性也存在差異。綜合比較分析，咪鮮胺能有效發(fā)地抑制本研究中測(cè)定的麗赤殼屬病原菌菌絲生長(zhǎng)。

桉樹(shù)；焦枯病；麗赤殼屬；殺菌劑；毒力測(cè)定

桉樹(shù)焦枯病是由麗赤殼屬(Calonectria)真菌引起的在熱帶和亞熱帶地區(qū)廣泛發(fā)生的一類世界性病害，麗赤殼屬真菌能夠危害桉樹(shù)葉片和枝梢，形成典型的爛葉和枯梢癥狀，嚴(yán)重影響桉樹(shù)的生長(zhǎng)[1-3]。在我國(guó)，桉樹(shù)焦枯病自報(bào)道以來(lái)一直備受關(guān)注，1991—1992年在廣西零星發(fā)生，1993年大面積流行發(fā)病，1996年桉樹(shù)焦枯病被列入到國(guó)內(nèi)森林病蟲害檢疫名單，其后大面積流行時(shí)有發(fā)生[4-6]。桉樹(shù)焦枯病主要發(fā)生在廣西、廣東、福建、云南和海南等地區(qū)的桉樹(shù)人工林中，嚴(yán)重影響我國(guó)桉樹(shù)人工林的健康發(fā)展[7-8]。麗赤殼屬真菌物種多樣性高、分類鑒定難等原因，導(dǎo)致桉樹(shù)焦枯病防治難度較大。目前，引起華南地區(qū)桉樹(shù)焦枯病的病原菌有 Ca. cerciana、Ca. crousiana、Ca. fujianensis、Ca.pauciramosa、Ca. pseudocolhounii和Ca. pseudoreteaudii共6種[2-3]。

我國(guó)針對(duì)桉樹(shù)焦枯病的化學(xué)防控研究已有報(bào)道，研究對(duì)象大都是一種麗赤殼屬病原菌[9-11]。由于同一區(qū)域存在不同的桉樹(shù)焦枯病病原菌[12]，對(duì)單一病原菌抑制效果好的殺菌劑不一定具有廣譜殺菌性。截至目前，尚未見(jiàn)對(duì)不同桉樹(shù)焦枯病病原菌進(jìn)行化學(xué)防控的報(bào)道。本研究選用6種常用殺菌劑對(duì)在我國(guó)發(fā)現(xiàn)的5種桉樹(shù)焦枯病病原菌進(jìn)行室內(nèi)毒力測(cè)定，以期為幼林以及苗圃中麗赤殼屬病原菌引起病害的防控提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 供試病原菌

桉樹(shù)焦枯病病原菌包括到目前為止在我國(guó)桉樹(shù)上發(fā)現(xiàn)和鑒定的5個(gè)Calonectria種，菌株包括5個(gè)Calonectria種的正模標(biāo)本菌株[2-3,12]，菌株來(lái)自于國(guó)家林業(yè)局桉樹(shù)研究開(kāi)發(fā)中心森林健康課題組菌種保藏庫(kù)和南非比勒陀利亞大學(xué)–林農(nóng)生物技術(shù)研究所菌種保藏中心(表1)。所有病原菌轉(zhuǎn)接于2% MEA培養(yǎng)基中培養(yǎng)7 d待用。

表1 試驗(yàn)所用桉樹(shù)焦枯病病原菌菌株信息

1.2 供試殺菌劑

供試殺菌劑共9種，各藥劑有效成分及生產(chǎn)廠家見(jiàn)表2。

表2 試驗(yàn)所用殺菌劑信息

1.3 供試培養(yǎng)基

2% MEA培養(yǎng)基(20 g麥芽粉，20 g瓊脂，1 L水)；含藥劑MEA培養(yǎng)基：將供試藥劑用無(wú)菌水配制成稀釋100倍母液，然后取母液加入冷卻至55℃左右的2% MEA培養(yǎng)基中，配制成有效成分濃度稀釋分別為500、1 000、4 000、10 000倍的含藥劑MEA培養(yǎng)基(表3)，倒入培養(yǎng)皿中備用。

表3 各供試藥劑不同稀釋倍數(shù)下有效濃度(mg·m L-1)

1.4 試驗(yàn)方法

預(yù)試驗(yàn)選用 9種殺菌劑(表 2)對(duì) Ca. cerciana (CMW 25309)、Ca. fujianensis(CMW 27254)、Ca. pseudoreteaudii(CMW 25292) 3種病原菌進(jìn)行室內(nèi)毒力測(cè)定，初步評(píng)價(jià)殺菌劑濃度對(duì)病原菌生長(zhǎng)抑制的影響效應(yīng)。用直徑5 mm的打孔器取培養(yǎng)7 d的病原菌菌餅，轉(zhuǎn)接至不同濃度梯度的含藥劑MEA平板中央，每個(gè)處理4次重復(fù)，設(shè)置不含藥劑MEA平板為對(duì)照。含藥劑MEA平板濃度分別是殺菌劑有效成分的1 000、4 000、10 000倍。放置于25℃下培養(yǎng)，8 d后，采用十字交叉法測(cè)量并記錄菌落直徑。

根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果選用6種殺菌劑(表2*標(biāo)注)對(duì)Ca. cerciana、Ca. crousiana、Ca. fujianensis、Ca. pauciramosai和Ca. pseudoreteaudii 5種桉樹(shù)焦枯病病原菌進(jìn)行室內(nèi)毒力測(cè)定。整個(gè)試驗(yàn)重復(fù)1次以保證試驗(yàn)數(shù)據(jù)可靠性。抑制率按照以下公式計(jì)算[13]。

菌落增長(zhǎng)直徑=菌落直徑?菌餅直徑

菌絲生長(zhǎng)抑制率(%)=(對(duì)照菌落增長(zhǎng)直徑?處理菌落增長(zhǎng)直徑)/對(duì)照菌落增長(zhǎng)直徑×100%

將藥劑各濃度(mg·L-1)轉(zhuǎn)換為對(duì)數(shù)值，各藥劑對(duì)病原菌的抑制率轉(zhuǎn)換為機(jī)率值，建立毒力回歸方程，并計(jì)算出藥劑抑制中濃度EC50和相關(guān)系數(shù)[14]。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)分析軟件和Excel進(jìn)行數(shù)據(jù)處理分析和整理。

2 結(jié)果與分析

2.1 殺菌劑預(yù)試驗(yàn)結(jié)果

預(yù)試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖1，由圖中比較分析結(jié)果可知，9種殺菌劑對(duì)Ca. cerciana(CMW25309)、Ca. fujianensis (CMW27254)、Ca. pseudoreteaudii (CMW25292) 3種病原菌均有不同程度的抑制作用。同一殺菌劑對(duì)不同病原菌的抑制作用也存在差異。部分殺菌劑不同濃度對(duì)病原菌的抑制效果差異不明顯。由此，正式試驗(yàn)選用抑菌效果好或?qū)Σ煌N病原菌抑制差異較大的6種殺菌劑為甲基硫菌靈、多菌靈、代森錳鋅、百菌清、咪鮮胺、嘧菌酯；濃度梯度為有效成分的500、1 000、10 000倍殺菌劑稀釋液。

2.2 殺菌劑對(duì)桉樹(shù)焦枯病病原菌菌絲生長(zhǎng)抑制率比較

6種殺菌劑對(duì)5種桉樹(shù)焦枯病病原菌菌絲生長(zhǎng)抑制作用見(jiàn)表4、圖2。6種殺菌劑對(duì)5種桉樹(shù)焦枯病病原菌均有一定的抑制作用，且差異顯著。殺菌劑濃度有效成分稀釋500倍時(shí)，咪鮮胺對(duì)5種病原菌的抑制率均在90%以上；代森錳鋅對(duì)5種病原菌的抑制率均在80%以上，其中對(duì)Ca. crousiana的抑制率達(dá)100%；甲基硫菌靈、多菌靈對(duì)Ca. cerciana、Ca. crousiana、Ca. fujianensis的抑制率在98%以上，而對(duì)Ca. pauciramosa和Ca. pseudoreteaudii的抑制率均在50%以下。殺菌劑濃度有效成分稀釋10 000時(shí)，咪鮮胺對(duì)5種病原菌的抑制率仍在80%以上；甲基硫菌靈、多菌靈對(duì)Ca. cerciana、Ca. crousiana、Ca. fujianensis的抑制率在均在 80%以上，對(duì) Ca. pauciramosa和Ca. pseudoreteaudii的抑制率下降到30%以下；代森錳鋅除對(duì)Ca. pseudoreteaudii抑制率為58.73%外，對(duì)其余病原菌的抑制率均在42%以下；而嘧菌酯、百菌清對(duì)5種桉樹(shù)焦枯病病原菌的抑制率均在40%以下。

同一種殺菌劑對(duì) 12株病原菌的抑制效果存在差異，不同殺菌劑對(duì)同一株病原菌的抑制效果也存在差異(表4)。此外，不同桉樹(shù)焦枯病病原菌對(duì)同一殺菌劑不同濃度的敏感性也存在差異，總體來(lái)說(shuō)，隨著有效成分濃度的升高，殺菌劑對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的抑制率隨之提高。在5種桉樹(shù)焦枯病病原菌中，以Ca. crousiana和Ca. fujianensis對(duì)6種殺菌劑的敏感性最高，而Ca. cerciana、Ca. pseudoreteaudii、Ca. pauciramosa的敏感性較低。

均1-H1%平劑菌1.02F1-H 1 1.13G1H1 1.10H1 2.90D1 2.85D1E1 2.93E1 0.33A1 0.44A1 1.11B1 1.90B1 1.88C1 1.62F1 3.51E1 3.36E1 3.17E1 1.09F1G1 1.15F1-H 1 0.99F示制殺.60±29.93±27.00±25.87±66.48±61.02±57.75±9794.19±.94±87.01±87.36±80.82±34.96±58.51±57.04±59.66±33.39±31.95±28z 2 表抑均W25310c/C-E -FD 的c/D-F d/D-F b/C d/C-F 1.83c/A cd/Cb/B 2.23a/B c/G b/F b/EFe/C-F e/F ef/Dd 1e1，a2,b 2…平株菌seudoreteaudii9±1.54CM4.484±8±2.615.354.049.749.004.863.943.972.432.402.0837.233.939.88±25.73±25.71±28.0100a/A3±91.06±66.3100a/A2a/A95.63±72.0±2.83b5.181±17.71±22.72±28.47±17.38±25.68±46.0性有顯對(duì)著所異劑5292Ca.p2.33b/DG /F1.56a/DF /EH E /GB C -F/C-F/D/H差菌的殺3.91dW2CM.55±.51±2.19e/H1.24a/A2.18b4.36a/B.36±.83±6.30b.96±4.81b.95b/I.82c/I4.88b2.68b2.28a/D5.74a/D5.73ab/EF1.90d1 1.41c2上種45274936.47±40180a/A10.71ab/AB95.88±95.19±85.34±76.09±477.88±26.75±3.76±19.48±56.88±54.73±40.30±50.20±48平每W27203d/F f/FG0.05水示d/G d/FG在Z1表1.671.011.462.53e/G 1.99a/A a/B 1.11a/B bc/C1.16c/E 2.931.49bc/D1.37b/D cd/E1.75f 1 1.620.97率2.063±8±21.65±12.69±16.817.18±13.8±1.15f/H4.64100a/A9±98.00±86.19±88.98±65.96±35.6±1.88c/H1.51±1.61c/H1.32±1.31c/H5.356±42.61±40.99±32.87±37.7制均，A1,B1…抑平性W27199e/H 的著d/E a/B 1.11D f/F a/B bc/C1.661.27d/GHc/I d/I d/FGb/C b/CDab/De 1f1 1.09株顯CM7±1±0.281.893±1.972±8±2.241.09±1.26f/I0.710.740.982.209ab/B 菌異19.815.75±18.112.4mosa2.6024.5100a/A95.394.2100a/A1±96.04±41.8±1.65b3.42±1.52c/I2.216±-0.00±45.25±42.24±CM7±39.841.8個(gè)差對(duì)上每的.83cd/B Ca劑平F 況-G.27e/EW25311G -G.69e/E.28g/E-GC c/CD.25e/E菌情.30f/E.94f/ECMF .34bc/A 4.39±11.51a/A120.89±3.09c/B0.18±18.79±3135.92±2率.90g/E6.31±10a/A2.64d/F2.48d/G2.63e/E.87±4.11cd/CD3.07b.23±2.94cde/D2.33g1 .pauciraz 1表)在制9444.13±1093517.21±2-6.80±-8.94±-5.16±.13±37.93±37.74±29.35±27，a1,b1…(縱e/D W252830.25抑c/D 0.98-Gbc/C0.813.827ab/ABfg/Ec/D 的B B 5.65示0.05水1.391ab/ABf/E 菌0.981.908f/Eg/E 7ab/AB1.87a/B b 1c1 2.21d 2率殺1.17制32.3病2±31.92±CM94.133.7100a/A原0±100a/A96.096.09±8±6±95.08±91.865.47a/A1a/A12.59±100a/A96.0F ±1.46±94.111.76±7±9.67性抑菌13.7病65.243.1著的原枯顯株病de/Ha/AB焦c/H c/D c/E W27257異菌b/AB0.82a-c/B a/C b/F 1.28d/G cd/H向0.65B 2.49de/Hd/HId-f/I b 1c1差對(duì)樹(shù)4±桉7±Ca.fujianensis2.106±0.054±0±0.566±6±0.48100a/A4±7.003±1.471.477±1.690.692±0a/A5a/B0.761.810±的劑34.35±32.05±8±33.582.474.6對(duì)95.993.888.8CM67.6上菌47.5劑33.5100a/A95.993.833.230.2c/H 26.664.6平殺水種B 菌E c/F 54/EF E /AF 72c/B 殺/D/DF /E0.05每)在表0.98bW246種2.17a/D1.79b0.44a/A2.23ab/B 0.33b0.45b1.00a/C3.41a/B2.33bB 1.32b0.77b1.21a/E1.49a1 1.19a2示CM43.97±41.41±47.99±100a/A99.02±92.06±95.74±92.96±86.23±100a/A92.38±50.30±100a/A96.00a/A94.00a/B47.16±43.89±43.83±75.94±70.35±向…Z表(橫制；A率,BH 53H 72-f/G抑性的著.crousianaCMW23.42b/E41.31±0.88a/D52.93±1.48c/F33.76±100a/A96.73ab/A 96.1a/A1.23c/B85.21±1.05d/B87.74±1.69b/C68.85±100a/A96.73a/A1.60de/H 25.06±100a/A96.73a/A96.10a/A1.37e/G27.13±2.36d/G29.49±1.79d28.04±1.80a1b1 70.69±株顯菌異同差Ca49B /F不的72/F/A1.66f/Fb/C 1.67d3.09d1.13bc/D 對(duì)上1.85a-c/BW21.38a/B劑平2.701.16e/E.87±1.48cd/E 1.51b.43±2.05a1b1 1.36a2 .28±CM菌1619160a/A10.61ab/B 95.41ab/B 93.21±96.61±94.07±940a/A10.61a/B95.59±510a/A10.61a/B95.52a/B94.81±27.49±31.39±36.17±70.54±70殺一0.05水同在。W25309/D-F-F1.38f/D/DB B /AB -F/Cc/C 0.92d示率性B 1.66a/A2.44b.09±2.96ab/B 0.12ab/AB2.25a/A8.03b抑顯8.81b2.54ef/DECMB 0.86f/D1.90d1.34ef/EF.70g/F2.32c1 .cerciana …z表制著均異22.16±18.53±15.69±96.20±91.84±880a/A10.15±96.77±92.11±69.89±65.15±210a/A10.27a/A96.40a/A94.64±14.93±119.02±0.61±61a,b母的的平差Ca字菌上5290-H/FH /HB /DD D -De/FGe/E F /E-H同原平W2-C-C不病水CM1.43d.54±2.39f/G1.92d0.47a/A2.48ab/A-D 3.35b2.09a/C5.32a/C3.39a/B1.47d1.33d1.04d1.26f/F2.13a1c1 1.58b2的種.69±.88±.31±.28±.29±0a/A.35ab/A-C .00±.21±.79±.55±0a/A.52a/A.35a/A.25±.63±.18±.10±.36±后每0.052219169993871096929292241094963226216764字對(duì))在數(shù)數(shù)劑向倍中菌500 103 104 500 103 104 500 103 104 500 103 104 500 103 104 500 103 104 (縱釋：稀表殺率劑靈菌鋅均均注菌酯硫胺錳靈清平平殺菌基鮮森菌菌株種

圖2 6種殺菌劑中3種不同濃度稀釋液對(duì)5種桉樹(shù)焦枯病菌菌絲的抑制作用

2.3 殺菌劑對(duì)桉樹(shù)焦枯病病原菌的EC50值比較

各藥劑毒力方程、相關(guān)系數(shù)及EC50值見(jiàn)表5。表中不同殺菌劑對(duì)同一種桉樹(shù)焦枯病病原菌的EC50差異很大，如Ca. cerciana能夠被多菌靈、咪鮮胺、甲基硫菌靈有效抑制，但是對(duì)代森錳鋅、百菌清和嘧菌酯不敏感；同一種殺菌劑對(duì)不同桉樹(shù)焦枯病病原菌的EC50也存在差異，如嘧菌酯只能有效抑制菌株CMW 25283、CMW 25311(Ca. pauciramosa)菌絲生長(zhǎng)，而對(duì)于其他菌株抑制效果不佳。根據(jù)EC50值判斷，甲基硫菌靈對(duì)CMW25311(Ca. pauciramosa)的毒力最小(EC50值最大)；嘧菌酯對(duì)CMW 25311(Ca. pauciramosa)的毒力最大(EC50值最小)。綜合比較分析，咪鮮胺對(duì)5種桉樹(shù)焦枯病病原菌的EC50值普遍較小，能有效地抑制桉樹(shù)焦枯病病原菌菌絲生長(zhǎng)。

表5 6種殺菌劑對(duì)桉樹(shù)焦枯病病原菌的毒力測(cè)定

續(xù)上表

3 結(jié)論和討論

本研究采用6種殺菌劑對(duì)5種桉樹(shù)焦枯病病原菌進(jìn)行了室內(nèi)毒力測(cè)定，結(jié)果表明不同殺菌劑對(duì)同種桉樹(shù)焦枯病病原菌菌絲生長(zhǎng)抑制作用差異顯著，同種殺菌劑對(duì)不同桉樹(shù)焦枯病病原菌的抑制作用也存在差異，因此需要針對(duì)各類焦枯病原菌篩選最佳殺菌劑進(jìn)行化學(xué)防控。

此前對(duì)桉樹(shù)焦枯病化學(xué)防控的研究是針對(duì)同一病原菌進(jìn)行多種殺菌劑的抑制效果測(cè)試，本研究顯示不同種桉樹(shù)焦枯病病原菌對(duì)同種殺菌劑的敏感性存在顯著差異，這進(jìn)一步證明我國(guó)桉樹(shù)焦枯病病原麗赤殼屬真菌存在物種多樣性。現(xiàn)今，苗圃或小面積桉樹(shù)焦枯病主要采用化學(xué)防治方法，但是桉樹(shù)焦枯病的病原菌存在物種多樣性[2-3]，這無(wú)疑給桉樹(shù)焦枯病的防治工作增加了難度。在實(shí)施桉樹(shù)焦枯病的化學(xué)防控過(guò)程中，首先要確定發(fā)病區(qū)域病原菌種類，進(jìn)而有針對(duì)性地選擇效果最好的殺菌劑。

本試驗(yàn)表明，咪鮮胺對(duì)所有供試菌株的菌絲生長(zhǎng)均有較好的抑制作用，是今后在生產(chǎn)上防治桉樹(shù)焦枯病的潛力藥劑。據(jù)報(bào)道，咪鮮胺已能夠有效抑制桉樹(shù)枝枯病(病原菌為L(zhǎng)asiodiplodia theobromae，Cryptospotiopsis sp.)[15]、核桃炭疽病(病原菌為Colletotrichum gloeosporioides)[16]、黃瓜靶斑病(病原菌為Corynespora cassiicola)[17]、蘋果炭疽病(病原菌為 Colletotrichumg loeosporioides)[18]病原菌菌絲生長(zhǎng)，目前已被廣泛用于多種植物的多種病害防控。此外，防治桉樹(shù)焦枯病也可用500倍代森錳鋅有效成分稀釋液與甲基硫菌靈或多菌靈混合使用，并與咪鮮胺輪換使用以有效控制病害發(fā)生。

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Laboratory Toxicity of Six Fungicides to Pathogens Cause Eucalyptus Leaf Blight Pathogens

LI Guo-qing1, CHEN Shuai-fei1,LIU Fei-fei1, ZHOU Xu-dong2, XIE Yao-jian1
(1. China Eucalypt Research Centre, Zhanjiang 524022, Guangdong, China；2. FuturaGene Biotechnology (Shanghai) Co.,Ltd, Shanghai 200235, China)

Eucalyptus leaf blight caused by Calonectria spp. is one of the most significant diseases of Eucalyptus worldw ide. In order to select effective fungicides to control the diseases caused by Calonectria spp. the toxicities of 6 fungicides (thiophanate-methyl, carbendazim, mancozeb, chlorothalonil, prochloraz, and azoxystrobin) to 5 Calonectria species (C. cerciana, C. crousiana, C. fujianensis, C. pauciramosa and C. pseudoreteaudii) were tested by evaluation of mycelial grow th post application. All 6 fungicides inhibited mycelial grow th of the 5 Calonectria species but to significantly different degrees. The inhibiting effect of different fungicides to the same species of Calonectria also proved significant, and differences were also found in the sensitivity of different Calonectria species to the same fungicide. In general, the fungicide prochloraz proved most efficient for inhibiting mycelial grow th of the 5 Calonectria species tested.

Eucalyptus; leaf blight; Calonectria; fungicide; toxicity

S763.15

A

2014-05-14

廣東省林業(yè)科技創(chuàng)新專項(xiàng)“桉樹(shù)重大病蟲害控制技術(shù)研究與示范(2010KJCX015-03)；廣東省自然科學(xué)基金“廣東桉樹(shù)焦枯病及無(wú)性系選擇研究”(10145624536-400000)；國(guó)家國(guó)際科技合作專項(xiàng)項(xiàng)目“重要林業(yè)病害致病力及多樣性研究”(2012DFG31830)

李國(guó)清(1988— )，在讀碩士研究生，主要研究方向：森林病害

＊陳帥飛為通訊作者.E-mail:cerccsf@126.com