李厚忠 張羽飛

中藥川貝對哮喘模型小鼠血管生成的影響※

李厚忠1張羽飛2

目的 確定中藥川貝對哮喘模型小鼠血管生成的作用及機(jī)制。方法建立哮喘模型小鼠并且將小鼠隨機(jī)分為三組，即模型組（OVA致敏的小鼠）、中藥川貝組（中藥川貝治療的小鼠）和PBS組（正常對照組的小鼠），中藥川貝組小鼠分別給予中藥川貝（9.0g/kg）。對模型小鼠的氣道炎癥、血管生成、血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）和缺氧誘導(dǎo)因子-1α（HIF-1α）進(jìn)行研究。結(jié)果與哮喘模型組小鼠相比，中藥川貝組可以改善過敏性氣道炎癥，并顯著減少血管百分比，也降低VEGF和HIF-1α的表達(dá)。血管百分比與VEGF和HIF-1α表達(dá)呈正相關(guān)，同時VEGF和HIF-1α表達(dá)呈正相關(guān)。結(jié)論結(jié)果表明，中藥川貝具有重要的抑制哮喘模型小鼠血管生成作用。中藥川貝通過抑制VEGF和HIF-1α表達(dá)實(shí)現(xiàn)抗血管生成活性。

血管生成；哮喘；中藥川貝；血管內(nèi)皮生長因子；缺氧誘導(dǎo)因子-1α

哮喘患者肺組織常伴有新生血管的生成，哮喘患者活組織檢查發(fā)現(xiàn)，不論血管的數(shù)量還是粗細(xì)均有所增加，這些改變可引起氣道阻塞和（或）氣道高反應(yīng)性，從而加重哮喘[1]。目前治療哮喘的一般方法是應(yīng)用糖皮質(zhì)激素、白三烯受體拮抗藥物等[2]，由于不良反應(yīng)嚴(yán)重，患者很難接受，那么尋找安全有效的中藥就顯得更加重要。中藥川貝治療哮喘安全可靠，可作為首選。

以往有研究表明，血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子（VEGF）在血管生成過程中起核心作用[3]。近年研究發(fā)現(xiàn)，VEGF調(diào)節(jié)血管生成是通過缺氧誘導(dǎo)因子-1α（HIF- 1α）實(shí)現(xiàn)的[4]，HIF-1α可以調(diào)節(jié)基因表達(dá)響應(yīng)氧氣濃度的變化。在本研究中建立哮喘小鼠模型，通過檢測氣道炎癥、血管百分比以及血管生成與VEGF和HIF-1α的關(guān)系，主要評價中藥川貝治療哮喘的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試藥中藥川貝粉的制備：選取整齊、粉性足者。由于川貝忌水洗，為去除藥材表面的灰塵，可采用潔凈的紗布擦拭藥材表面。凈選后的川貝通過滅菌消毒窗消毒15min后直接轉(zhuǎn)至粉碎車間，用Fz-400型粉碎機(jī)組加工成100目細(xì)粉，收得細(xì)粉裝入潔凈的容器中，封口。全部加工完后的細(xì)粉用潔凈的塑料袋分裝成1kg/袋備用。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物雌性BALB/C小鼠30只，6～8周齡，由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心提供，實(shí)驗(yàn)動物合格證號為P00102008。

1.3 模型建立健康清潔級 BALB/C小鼠腹腔內(nèi)注射10%卵蛋白+10%氫氧化鋁混合液1m l作為首次致敏，第15天將小鼠依次置于超聲霧化器中，用1%卵蛋白生理鹽水噴霧激發(fā)小鼠哮喘發(fā)作，隔日一次，一次 20m in，共激發(fā) 28d。以小鼠出現(xiàn)口唇發(fā)紺、腹肌痙攣、呼吸加快、點(diǎn)頭呼吸或站立不穩(wěn)等現(xiàn)象表示成功激發(fā)。將成功制備的哮喘模型小鼠（20只）隨機(jī)分為兩組（每組10只）。分別為模型組和中藥川貝組，另設(shè)PBS組（10只以生理鹽水代替卵蛋白進(jìn)行腹腔注射及霧化吸入給藥）。分組后每天灌胃給藥，模型組和PBS組給予等量生理鹽水，中藥川貝組給予川貝粉9.0g/kg，每天1次，連續(xù)28d。最后1次給藥2h后，三組小鼠應(yīng)用1%巴比妥鈉麻醉，取出肺組織保存，待用于組織學(xué)檢測。

1.4 組織學(xué)分析肺組織采用 4%多聚甲醛固定、石蠟包埋、切片、蘇木精和伊紅染色、數(shù)字顯微鏡掃描。根據(jù)組織學(xué)評分系統(tǒng)對支氣管周圍炎癥進(jìn)行評分：①支氣管周圍無炎細(xì)胞；②可見少量炎細(xì)胞；③大量炎細(xì)胞，但未完全浸潤支氣管；④1層炎細(xì)胞完全浸潤支氣管；⑤2層炎細(xì)胞完全浸潤支氣管；⑥3層或更多炎細(xì)胞完全浸潤支氣管。使用所有肺組織的支氣管除以有炎癥的支氣管計(jì)算平均支氣管炎癥指數(shù)。

1.5 免疫組化法檢測VEGF和HIF-1α表達(dá)及計(jì)算血管百分比肺組織石蠟切片、脫蠟、脫水、浸泡于3% H2O2中15min滅活內(nèi)源性過氧化物酶。置于煮沸檸檬酸鈉中修復(fù)抗原，暴露抗原表位并且用3%小牛血清蛋白阻斷。切片與血管性血友病因子（vWF）初級抗體孵育。VEGF和HIF-1α分別于4℃過夜，隨后與二氨基聯(lián)苯胺孵育。用均勻結(jié)合在內(nèi)皮細(xì)胞表面的 vWF抗體標(biāo)記血管，所有的后續(xù)步驟均在ZSGB-BIO Autostainer進(jìn)行。隨機(jī)選定一個 HPF（200×）視野，像場的總面積除以vWF陽性面積即得血管百分比，免疫組化染色支氣管上皮細(xì)胞用于計(jì)算VEGF和HIF-1α表達(dá)。

1.6 Western blotting檢測VEGF和HIF-1α表達(dá)在蛋白酶抑制劑的存在下肺組織勻漿，以獲得肺蛋白提取物，用于Western blotting分析，使用bca-100蛋白定量分析試劑盒確定濃度。每組蛋白質(zhì)等量（30μg）固定SDS聚丙烯酰胺凝膠，然后轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，膜在三異丙基乙磺酰緩沖鹽水吐溫20（25mM Tris pH 7.5，150mM NaCl和0.1% Tween 20）中用5%的脫脂奶粉封閉1h，與原發(fā)性抗VEGF抗體或抗-HIF-1抗體4℃過夜孵育，然后與二抗雜交（Dako,1:2000），增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光顯示特異性結(jié)合，以 β-Actin為內(nèi)參，X射線掃描，計(jì)算機(jī)輔助雙向光密度計(jì)分析光密度，計(jì)算VEGF和HIF- 1α表達(dá)的相對比例。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析和 Mann Whitney檢驗(yàn)相關(guān)數(shù)據(jù)的分布。VEGF和HIF-1α表達(dá)與血管百分比的相關(guān)性采用Spearman檢驗(yàn)評價。P＜0.05為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 中藥川貝改善過敏性氣道炎癥組織學(xué)分析顯示，模型組呈典型哮喘病理特征（圖1A）。許多炎細(xì)胞浸潤支氣管周圍，支氣管上皮增厚，與PBS組比較炎癥指標(biāo)明顯增強(qiáng)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。給予中藥川貝干預(yù)后，氣道炎癥明顯改善，炎細(xì)胞減少，支氣管上皮增厚范圍縮?。▓D1B），與模型組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見表1。

圖1 小鼠肺組織組織病理學(xué)切片(200×)

表1 三組哮喘模型小鼠血管生成影響的指標(biāo)情況比較[(±s),n=10]

表1 三組哮喘模型小鼠血管生成影響的指標(biāo)情況比較[(±s),n=10]

注：模型組與PBS組比較**P＜0.01；中藥川貝組與模型組比較※※P＜0.01，※P＜0.05

指標(biāo) 模型組 中藥川貝組 PBS組平均炎癥指數(shù) 4.79±0.21※※ 2.91±0.17** 1.60±0.15血管百分比 2.82±0.78※※ 0.77±0.13** 0.42±0.10 VEGF表達(dá) 93.29±1.55※※26.25±1.08** 23.08±2.79 VEGF表達(dá)相對比 2.08±0.30※※ 1.12±0.22** 0.96±0.30 HIF-1α表達(dá) 89.60±0.79※※71.70±1.40** 11.70±0.30 HIF-1α表達(dá)相對比 0.97±0.30※ 0.88±0.47** 0.32±0.12

2.2 中藥川貝降低血管生成OVA致敏后，血管生成（圖2）。模型組血管百分比明顯升高，與PBS組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。給予中藥川貝干預(yù)后，血管百分比明顯降低，與模型組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見表1。

圖2 小鼠肺組織vWF陽性血管面積(200×)

2.3 中藥川貝降低VEGF表達(dá)模型組支氣管上皮細(xì)胞，肺泡上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞VEGF表達(dá)明顯升高，中藥川貝干預(yù)后，VEGF表達(dá)接近PBS組（圖3，表1）。Western blotting結(jié)果顯示，在模型組VEGF表達(dá)明顯升高，與PBS組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；中藥川貝干預(yù)后，VEGF表達(dá)降低，與PBS組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見圖4和表1。

圖3 小鼠肺組織VEGF表達(dá)(200×)

圖4 Western blotting結(jié)果

2.4 中藥川貝降低HIF-1α表達(dá)為進(jìn)一步闡明中藥川貝抗血管生成機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)還檢測了肺組織HIF-1α表達(dá)水平。PBS組僅可見少量HIF-1α陽性細(xì)胞，而在模型組肺泡上皮細(xì)胞核HIF-1α高表達(dá)（圖4～5）。Western blotting檢測HIF-1α相對比，結(jié)果顯示模型組HIF-1α表達(dá)上調(diào)，與PBS組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；中藥川貝組HIF-1α表達(dá)下調(diào)，與模型組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，表1）。

圖5 小鼠肺組織HIF-1α表達(dá)(400×)

2.5 血管百分比與VEGF和HIF-1α表達(dá)相關(guān)性 Western blotting結(jié)果顯示（圖4），血管百分比與VEGF（r = 0.693，P＜0.01）和HIF-1α（r = 0.785，P＜0.01）表達(dá)程正相關(guān)，因此VEGF和HIF-1α表達(dá)呈正相關(guān)（r = 0.641，P＜0.05)。

3 討論

為闡明中藥川貝抗血管形成機(jī)制，本研究檢測了平均炎細(xì)胞指數(shù)和血管百分比。哮喘模型小鼠肺組織可見大量炎細(xì)胞浸潤支氣管周圍，同時支氣管上皮細(xì)胞損傷，炎癥是哮喘加重的一個重要因素[5]。炎癥效應(yīng)細(xì)胞（肥大細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等）是血管形成的主要誘因，這與哮喘患者血管生成增多相一致[6-8]，哮喘模型小鼠血管百分比明顯增加。本研究發(fā)現(xiàn)，中藥川貝不僅可以改善氣道炎癥，而且還可以減少血管生成，結(jié)果證實(shí)中藥川貝具有抗血管生成作用。

本研究證實(shí)了VEGF和HIF-1α表達(dá)的關(guān)系。近年研究表明，VEGF的激活受HIF-1α調(diào)控，哮喘發(fā)作時HIF-1α表達(dá)增加，從而使VEGF表達(dá)上調(diào)，最終引起血管生成增加，這與文獻(xiàn)結(jié)果相一致。

在哮喘模型小鼠還發(fā)現(xiàn)支氣管上皮細(xì)胞，肺泡內(nèi)皮細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞VEGF表達(dá)增加，此結(jié)果明確了VEGF表達(dá)和血管百分比之間的關(guān)系。眾所周知，在血管生成過程中，VEGF起核心作用[9]。中藥川貝降低降低VEGF表達(dá)，抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖和血管生成，最終降低血管百分比，VEGF表達(dá)降低可能是中藥川貝抗血管生成的機(jī)制之一。

終上所述，中藥川貝可以減輕氣道炎癥，降低VEGF和HIF-1α表達(dá)，從而抑制哮喘模型小鼠肺組織血管生成，本研究支持中藥川貝支持治療人類哮喘的良好作用。

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The Effects of Bulbus Fritillariae Cirrhosae on Angiogenesis in a M urine Asthma model

Li Houzhong Zhang Yufei

Ob jec tive The aim of this study is to determ ine the effects and mechanism s of Bulbus Fritillariae Cirrhosae on angiogenesis in a murine asthma mode l.MethodsA m ouse m odel o f asthm a was estab lished and the m ice were random ly divided into three groups,nam ely the m odel group (OVA sensitized m ice),Chinese m edicine group (TCM Chuanbei Chuanbei treated m ice) and group PBS (norm al control group m ice),Chinese m edicine fritillary bu lb group m ice were given traditiona l Chinese m edicine Fritillary (9.0g/kg). Airway inflamm ation, blood vessel formation,vascular endothelial grow th factor on model m ice (VEGF) and hypoxia inducible factor -1α (HIF-1α) stud.Resu ltsAdm inistration o f Bu lbus Fritillariae Cirrhosae am eliorated allergic airway inflamm ation and significantly reduced the percentage vascu larity com pared w ith those in the asthm atic mode l m ice.It a lso reduced the expression of HIF-1α,as we ll as that o f VEGF.Percentage vascularity had positive corre lation w ith both HIF-1α and VEGF expression.Furtherm ore,there is positive re lationship between HIF-1α and VEGF exp ression.Conc lusionThe results demonstrate that Bulbus Fritillariae Cirrhosae has an im portant inhibitoryeffect on angiogenesis in asthma. Inhaled adm inistration o f Bulbus Fritillariae Cirrhosae achieved anti-angiogenic activity through inhibition of HIF-1α and VEGF expression.

Angiogenesis;Bu lbus Fritillariae Cirrhosae;Asthm a;VEGF;HIF-1α

R285.5

A

1673-5846(2014)05-0193-03

1牡丹江醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，黑龍江牡丹江 157011

2牡丹江醫(yī)學(xué)院醫(yī)藥研究中心，黑龍江牡丹江 157011

牡丹江醫(yī)學(xué)院科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目（編號：2010-34）

李厚忠（1979-），黑龍江省哈爾濱市呼蘭區(qū)人，碩士，主要從事藥理學(xué)和毒理學(xué)研究。

張羽飛（1981-），碩士，主要從事男性生殖研究工作。E-mail：yufeizhang@foxmail.com。