李趣嫦 朱歡敏 肖建光

鹽酸左氧氟沙星片微生物限度檢測的方法學(xué)建立和驗(yàn)證

李趣嫦 朱歡敏 肖建光

目的 建立了鹽酸左氧氟沙星片微生物限度的檢測方法，并對方法學(xué)進(jìn)行驗(yàn)證。方法采用低速離心結(jié)合薄膜過濾手段建立鹽酸左氧氟沙星片的微生物限度檢測方法。結(jié)果細(xì)菌計(jì)數(shù)及控制菌用薄膜過濾法檢查，霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)用常規(guī)法檢查。結(jié)論該方法準(zhǔn)確、可靠，適用于左氧氟沙星片的微生物檢查。

左氧氟沙星片；微生物限度；方法學(xué)；建立；驗(yàn)證

鹽酸左氧氟沙星片適用于敏感細(xì)菌引起的輕、中度感染，主要用于呼吸道系統(tǒng)感染、泌尿系統(tǒng)感染、生殖系統(tǒng)感染、皮膚軟組織感染、腸道感染、敗血癥、粒細(xì)胞減少及免疫功能低下患者和各種感染等，有抗菌譜廣、抗菌作用強(qiáng)的特點(diǎn)。本文根據(jù)《中國藥典》2010版[1]的要求，建立了鹽酸左氧氟沙星片的微生物限度檢查方法，并對方法學(xué)進(jìn)行了驗(yàn)證。

1 儀器與試藥

1.1 菌種金黃色葡萄球菌[CMCC(B)26003]、大腸埃希菌[CMCC(B)44102]、枯草芽孢桿菌[CMCC (B)63501]和白色念珠菌[CMCC(F)10123]均購自中國食品藥品檢定研究院；黑曲霉（ATCC16404）購自于廣東省微生物研究所。

1.2 培養(yǎng)基營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基，營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，改良馬丁培養(yǎng)基，改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基，膽鹽乳糖培養(yǎng)基，MUG培養(yǎng)基，曙紅亞甲藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基。

1.3 供試品鹽酸左氧氟沙星片，批號(hào)：20111101、20120101、20120301，規(guī)格：0.1g，生產(chǎn)廠家：廣東彼迪藥業(yè)有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 菌液的制備

2.1.1 大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌 取新鮮培養(yǎng)物接種至營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，置30～35℃培養(yǎng)18～24h；培養(yǎng)物用0.9%無菌氯化鈉溶液制成每1m l含菌數(shù)為50～l00cfu的菌懸液。用于控制菌驗(yàn)證時(shí)配制成每1m l含菌數(shù)小于l00cfu的菌懸液。

2.1.2 白色念珠菌 取新鮮培養(yǎng)物接種至改良馬丁培養(yǎng)基中，置23～28℃培養(yǎng)24～48h；培養(yǎng)物用0.9%無菌氯化鈉溶液制成每1ml含菌數(shù)為50～l00cfu的菌懸液。

2.1.3 黑曲霉 取新鮮培養(yǎng)物接種至改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)基中，置23～28℃培養(yǎng)5～7d，加入3～5ml含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫。然后，采用適宜的方法吸出孢子懸液至無菌試管內(nèi)，用含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液制成每lml含孢子數(shù)50～l00cfu的孢子懸液。

2.2 供試液的制備取樣品10g，加入pH7.0的氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100ml，用勻漿儀打碎，制成1:10供試液。

2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

2.3.1 霉菌及酵母菌計(jì)數(shù) 取1:10供試液1ml和試驗(yàn)菌液1ml注入平皿中，立即傾注玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基，每株試驗(yàn)菌平行制備2個(gè)平皿。試驗(yàn)獨(dú)立進(jìn)行3次，見表1。可見平皿法3次試驗(yàn)，兩株菌株的回收率均大于70%，故鹽酸左氧氟沙星片的霉菌和酵母菌計(jì)數(shù)按平皿法檢查。

表1 霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)回收率測定結(jié)果(平皿法)(%)

2.3.2 細(xì)菌計(jì)數(shù) 方法一：取 1:10的供試液，以500r/min離心3min，分別各取上清液1ml，加至含0.1%聚山梨酯80的pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液100ml中，搖勻，濾過，用含0.1%聚山梨酯80的pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液1000ml沖洗濾膜，每次 100ml。試驗(yàn)結(jié)果：大腸埃希菌菌株的回收率僅為 8%，故此方法并不適合作為細(xì)菌計(jì)數(shù)檢查方法。方法二：取 1:10的供試液，以 500r/min離心3min，取上清液10ml，加pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100ml，混勻，作為1:100的供試液。取1:100供試液1ml，加至45℃ pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液100ml中，搖勻，濾過，用45℃pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液200ml沖洗濾膜，每次100ml。試驗(yàn)獨(dú)立進(jìn)行3次，由表2可見，薄膜過濾法3次試驗(yàn)，三株菌株的回收率均大于70%，故鹽酸左氧氟沙星片的細(xì)菌計(jì)數(shù)采用薄膜過濾法檢查。

表2 細(xì)菌計(jì)數(shù)回收率測定結(jié)果(方法二)(%)

2.4 控制菌檢查法的驗(yàn)證方法一：取 1:10的供試液，以500r/min離心3min，取上清液5ml，加至45℃含0.1%聚山梨酯80的pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液100ml中，搖勻，過濾，用45℃含0.1%聚山梨酯 80的 pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液1000ml分10次沖洗濾膜，在最后1次沖洗液中加入大腸埃希菌菌液 1ml，濾干，然后取出濾膜，平行做兩份，取膜至800ml膽鹽乳糖培養(yǎng)基中，按大腸埃希菌的檢查法進(jìn)行驗(yàn)證。由表3結(jié)果可知，本品對大腸埃希菌有較強(qiáng)的抑制作用，此方法不適合該品種的大腸埃希菌檢查。方法二：取1:10的供試液，以 500r/min離心 3min，取上清液 5ml，加入45℃含1%聚山梨酯80的pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液500ml中，搖勻，過濾，用45℃含1%聚山梨酯80的pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液500ml沖洗濾膜，每次100ml，在最后1次沖洗液中加入大腸埃希菌菌液 1ml，濾干，然后取出濾膜，平行做兩份，取膜至 1000ml的膽鹽乳糖培養(yǎng)基中，按大腸埃希菌的檢查法進(jìn)行驗(yàn)證，見表3。

表3 控制菌驗(yàn)證結(jié)果

3 討論

鹽酸左氧氟沙星對大多數(shù)腸桿菌科細(xì)菌，如大腸埃希菌、沙門氏菌屬、變形桿菌屬等革蘭陰性細(xì)菌有較強(qiáng)的抗菌活性，故將大腸埃希菌作為實(shí)驗(yàn)的敏感菌株。在細(xì)菌計(jì)數(shù)驗(yàn)證中，用1:10供試液，沖洗量為1000ml，大腸埃希菌的驗(yàn)證回收率無法達(dá)到70%以上。根據(jù)《中國藥典》2010版[1]二部附錄ⅪⅩP微生物限度檢查法應(yīng)用指導(dǎo)原則，“進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)時(shí)，若沒有適宜的方法消除供試品中的抑菌作用而導(dǎo)致微生物回收的失敗，應(yīng)采用能使微生物生長的更高稀釋級(jí)供試液進(jìn)行方法驗(yàn)證試驗(yàn)”。因此本文擬用1:100供試液，用薄膜過濾法進(jìn)行驗(yàn)證。

有文獻(xiàn)報(bào)道[2]，硫酸錳中Mn2+作為二價(jià)金屬離子可以和喹諾酮類抗生素發(fā)生絡(luò)合反應(yīng)，生成物無抑菌作用。但實(shí)驗(yàn)過程卻發(fā)現(xiàn)硫酸錳會(huì)與膽鹽乳糖培養(yǎng)基發(fā)生反應(yīng)，產(chǎn)生渾濁或生成絮狀沉淀的現(xiàn)象，直接降低培養(yǎng)基的營養(yǎng)成份。本文采用薄膜過濾法及培養(yǎng)基稀釋法能很好地消除本品的抑菌性，方法簡便可行，重復(fù)性好。

[1] 中華人民共和國國家藥典委員會(huì).中國藥典(二部)[M].北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2010:附錄ⅩⅠⅩ.

[2] 劉濤,朱斌,韋濤,等.氧氟沙星栓微生物限度檢查方法探討[J].臨床合理用藥,2010,3(20):4-5.

Development and Validation of a M icrobial Lim it test M ethod for Levofloxacin Hydrochloride tablets

Li Quchang Zhu Huanm in Xiao Jianguang

Ob jec tiveTo deve lop and va lidate a m ethod for m icrobial lim it detection o f levofloxacin hydrochloride tablets.MethodsLow-speed centrifugation and m em brane filtration app roaches were used for the development o f m icrobial lim it detection method for levofloxacin hydrochloride tablets.Resu ltsThe bacteriad and the control of bacteria were determ ined by m embrane filtration app roach,m o lds and yeast were determ ined by routine app roach.Conc lusionThe method is accurate,re liab le,and suitab le for detection of the m icrobia l lim it of levo floxacin hydrochloride tablets.

Levo floxacin tablets;M icrobia l lim it detection;Method;Developm ent;Va lidation

R927.11

A

1673-5846(2014)05-0016-02

廣東省食品藥品檢驗(yàn)所微生物室，廣東廣州 510180

李趣嫦（1982 -），學(xué)士，主管藥師。研究方向：藥物分析。E-mail：liquchang@sohu.com。