倪曉燕，王榮海，宋禮華，儲成風，李增禮，周樂春

（1.安徽中醫(yī)藥大學，安徽 合肥 230031；2.安徽安科生物工程（集團）股份有限公司，安徽 合肥 230088；3.安徽省生物研究所，安徽 合肥 230088）

重組人干擾素α2b注射液穩(wěn)定性研究

倪曉燕1，2，王榮海2，3，宋禮華2，3，儲成風2，李增禮2，周樂春2

（1.安徽中醫(yī)藥大學，安徽 合肥 230031；2.安徽安科生物工程（集團）股份有限公司，安徽 合肥 230088；3.安徽省生物研究所，安徽 合肥 230088）

目的 考察重組人干擾素α2b注射液的穩(wěn)定性。方法 按照《中國藥典》2010年三部的方法進行檢測，其中干擾素蛋白純度采用高效液相法測定，光照試驗、振搖試驗、凍融試驗、加速試驗、低溫長期留樣觀察方法均采用藥典方法。結果 除了凍融試驗中反復凍融8次后和加速試驗中（37±2）℃放置3個月，干擾素 α2b效價下降至理論值的80%以下，其余試驗抽樣點均符合質(zhì)量標準的規(guī)定。結論 該品在避光，2～8℃密閉的儲存條件下性質(zhì)穩(wěn)定，貯存期可為2年左右。

重組人干擾素 α2b注射液；穩(wěn)定性；無血清處方

重組人干擾素被廣泛的應用于治療毛細管白血病、喉多發(fā)性乳頭瘤病、艾滋?。ˋcquired Immune Deficiency Syndrome，AIDS）相關的卡波西肉瘤、急慢性病毒性肝炎、病毒性角膜炎［1-2］疾病，通常被制成凍干制劑或液體制劑。為保護干擾素活性，通常在制劑配方中加入人血白蛋白（Human Sero Albumin，HSA）或白蛋白替代品羥乙基淀粉、葡聚糖、聚山梨酯80、聚乙二醇等。HSA價格昂貴，并且會帶來感染血液病毒的風險。聚山梨酯80屬于親水型非離子表面活性劑，常用作助溶劑、乳化劑和穩(wěn)定劑等。有研究發(fā)現(xiàn)聚山梨酯80可能會造成囊狀細胞的退化，從而引起外周神經(jīng)毒性［3］。聚山梨酯 80本身具有不穩(wěn)定性［4］，還能導致溶血發(fā)生，應慎用含吐溫80的靜脈注射劑［5-6］。因此，本課題旨在尋找一種既不含有 HSA也不含有吐溫80，并且能保持干擾素生物活性的液體制劑配方。在參考國內(nèi)外文獻資料的基礎上，通過研究確定了以組氨酸、EDTA二鈉、氯化鈉、磷酸鹽緩沖液等組成重組人干擾素 α2b注射液的處方，以下是對此處方穩(wěn)定性進行的系統(tǒng)研究。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 凈化工作臺（SW-CJ-1F型，蘇州凈化設備有限公司），CO2培養(yǎng)箱（2406-2，Shel Lab），倒置顯微鏡（XPS-1B，重慶光電儀器有限公司），Waters 1525高效液相色譜儀，Waters 1489紫外-可見檢測器，Breeze 2數(shù)據(jù)采集軟件控制（Waters），TSK G2000SWXL色譜柱，實驗室 pH計（FE20，Mettler Toledo），萬分之一電子天平（ML203，Mettler Toledo），恒溫培養(yǎng)箱（BSC-150，上海博訊實業(yè)有限公司）。

1.2 試藥 重組人干擾素 α2b注射液［安徽安科生物工程（集團）股份有限公司提供，規(guī)格：每支600 萬IU，批號20110607、20110611、20110615］，異丙醇為色譜純，其余試劑均為分析純。WISH細胞株，VSV病毒［安徽安科生物工程（集團）股份有限公司提供］。IFN-α標準品購于中國藥品生物制品檢定所（批號：07-01）。

2 方法

2.1 試驗方法

2.1.1 光照試驗 將重組人干擾素 α2b注射液置于裝有日光燈的冰箱里，照度條件為（4 500±500）Lx，溫度2～8℃，與第5天和第10天取樣，按考察項目檢測。

2.1.2 振搖試驗 避光，室溫下，將重組人干擾素α2b注射液置于搖床（250 r·min-1）中振搖，第4天、第8天取樣按考察項目檢測。

2.1.3 凍融試驗 重組人干擾素α2b注射液反復凍融0、2、4、6、8次后，按考察項目檢測。反復凍融試驗的具體操作方法是：將供試品置于 -20℃冰箱中12 h使供試品溶液完全凍結，然后取出置于 2～8℃冰箱中8 h使供試品溶液完全融化成液體狀態(tài)，如此反復多次，分別取樣檢測。

2.1.4 加速試驗 將重組人干擾素 α2b注射液置于（25±2）℃條件下，于0、1、2、3、6月分別取樣；將重組人干擾素 α2b注射液置于（37±2）℃條件下，于0、1、2、3月分別取樣，上述樣品按考察項目檢測。2.1.5 低溫長期試驗 將重組人干擾素 α2b注射液置于（6±2）℃條件下，于0、3、6、9、12、18、24月分別取樣，按考察項目檢測。

2.2 檢測項目 外觀性狀、干擾素效價（生物學活性）、pH值、蛋白純度、無菌檢查。長期試驗最后一個時間點增加異常毒性檢測。

2.3 檢測方法 蛋白純度采用高效液相色譜法檢測。色譜條件為：色譜柱TSK G2000SWXL；流動相為20 mmol·L-1磷酸鹽—145 mmol·L-1氯化鈉—5%異丙醇緩沖液，pH 7.0；上樣量200 μL；在波長280 nm處檢測，按面積歸一化法計算。其余檢測項均按照 2010《中國藥典》三部［7］的規(guī)定檢查。

3 結果

3.1 光照試驗 重組人干擾素α2b注射液強光照射第5天和第10天取樣按考察項目檢測，結果表明強光照射后，干擾素效價沒有降低，在合格范圍內(nèi)，結果見圖1。注射液外觀性狀、pH值、蛋白純度均無明顯變化，無菌試驗合格，結果見表1。

3.2 振搖試驗 重組人干擾素α2b注射液在室溫下振搖第4天、第8天后取樣檢測，結果表明干擾素效價沒有降低，在合格范圍內(nèi)，結果見圖 2；其它項均無明顯變化，結果見表2。

圖1 光照試驗干擾素效價結果

表1 重組人干擾素α2b注射液在強光下的穩(wěn)定性結果

圖2 振搖試驗干擾素效價結果

表2 重組人干擾素α2b注射液在振搖下的穩(wěn)定性結果

3.3 凍融試驗 重組人干擾素 α2b注射液反復凍融2、4、6、8次后分別取樣檢測，結果表明反復凍融6次，干擾素效價雖有降低但仍在合格范圍內(nèi)，但反復凍融8次后，干擾素效價大幅度降低，且已低于0時效價的80%，結果見圖3；樣品其余檢測項均無明顯變化，結果見表3。

3.4 加速試驗 重組人干擾素 α2b注射液分別在（25±2）℃條件下儲存6個月和在（37±2）℃條件下儲存2個月，干擾素效價均在合格范圍內(nèi)，但在（37±2）℃條件下儲存 3個月干擾素效價降低至 0時效價的80%以下，結果見圖4-1、4-2；樣品其余檢測項均無明顯變化，結果見表4-1、4-2。

圖3 凍融試驗干擾素效價結果

表3 重組人干擾素α2b注射液在反復凍融下的穩(wěn)定性結果

圖4-1 加速試驗干擾素效價結果（25±2℃）

圖4-2 加速試驗干擾素效價結果（37±2℃）

3.5 低溫長期試驗 取3批重組人干擾素α2b注

表4-1 重組人干擾素 α2b注射液加速試驗結果（25±2℃）

表4-2 重組人干擾素 α2b注射液加速試驗結果（37±2℃）

射液置于（6±2）℃條件下，于 0、3、6、9、12、18、24月取樣檢測的結果見表 5。結果表明，本品在低溫環(huán)境下留樣 24個月，干擾素效價在合格范圍內(nèi)保持穩(wěn)定，結果見圖5；本品 24月異常毒性試驗結果合格；其余各項指標與 0時相比無明顯變化，均符合質(zhì)量標準，結果見表5。

圖5 低溫長期試驗干擾素效價結果

4 討論

重組人干擾素 α2b凍干制劑雖具有保存期長、生物活性穩(wěn)定等優(yōu)點，但其冷凍干燥的過程非常復雜，藥物的結構可能受其中的物理化學變化影響而發(fā)生變化，特別是蛋白質(zhì)多肽類藥物的二、三級結構易受破壞［8-10］。并且凍干制劑病人使用之前還需要復溶，依從性差。因此從經(jīng)濟和使用便捷性方面考慮，市場更青睞可長期穩(wěn)定保存干擾素液體制劑。

表5 重組人干擾素 α2b注射液低溫長期試驗結果（6±2℃）

本課題通過研究確定了由組氨酸、EDTA二鈉、氯化鈉、磷酸鹽緩沖液等組分構成的重組人干擾素α2b注射液，不含HSA和聚山梨酯80。L-組氨酸是一種半必需氨基酸，氨基酸是一種常見的蛋白質(zhì)保護劑［11］，有文獻報道其用于重組人紅細胞生成素中［12］。EDTA二鈉作為絡和劑、洗滌劑、血液抗凝劑及金屬掩蔽劑廣泛應用于分析化學領域，每天攝入量不得超過2.5 mg·kg-1［13］，在干擾素注射液中EDTA二鈉的含量可以通過 HPLC法準 確 測 定［14］。

我們篩選出的此種不含 HSA、吐溫 80的重組人干擾素α2b注射液，在強光照射、室溫振搖、反復凍融、加速試驗中，均保持較好的穩(wěn)定性。在 6±2℃儲存條件下，干擾素活性能保持2年基本不變。通過系統(tǒng)穩(wěn)定性研究結果，我們可知由組氨酸、EDTA二鈉、氯化鈉、磷酸鹽緩沖液組成的制劑配方能較好的保護重組人干擾素 α2b生物活性，其制劑在避光、2～8℃密閉儲存 2年質(zhì)量符合《中國藥典》2010版規(guī)定。

［1］ Perrillo R.Benefits and risks of interferon therapy for hepatitis B ［J］.Hepatology，2009，49（5 Suppl）：S103-111.

［2］ 蘇曉鋒.干擾素在不同類型病毒性角膜炎中的療效和安全性觀察［J］.安徽醫(yī)藥，2013，17（5）：852-853.

［3］ Freilich RJ，Balmaceda C，Seidnan AD，et a1.Motor neuropathy due to docetaxel and paclitaxel［J］.Neurology，1996，47：l15.

［4］ 譚志高，巢志茂，劉海萍，等.聚山梨脂80的化學穩(wěn)定性研究進展［J］.中國實驗方劑學雜志，2012，18（1）：251-254.

［5］ 李寅超，郭 琰，吳翠萍，等.6種不同來源的注射用吐溫 80致敏性和溶血性實驗研究［C］.上海：首屆中國藥物毒理學年會（2011年）暨國際藥物非臨床安全性評價研究論壇，2010：160 -164.

［6］ 吳 毅，金少鴻.藥用輔料吐溫80的藥理、藥動學及分析方法研究進展［J］.中國藥事，2008，22（8）：717-719.

［7］ 國家藥典委員會.中國藥典：三部［S］.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：268-269.

［8］ 劉占杰，華澤釗.蛋白質(zhì)藥品冷凍干燥過程中變性機理的研究進展［J］.中國生化藥物雜志，2000，21（5）：263-265.

［9］ 武華麗，胡一橋.冷凍干燥制劑的穩(wěn)定性研究進展［J］.中國藥學雜志，2001，36（7）：436-438.

［10］張玉華，凌沛學，籍保平.糖類在生物活性物質(zhì)冷凍干燥中的保護作用及其作用機制［J］.中國生化藥物雜志，2006，27（4）：247-249.

［11］Pikal-Cleland KA，Cleland JL，Anchordoquy TJ，et al.Effect of glycine on pH changes and protein stability during freeze-thawing in phosphate buffer systems［J］.J Pharm Sci，2002，91（9）：1969-1979.

［12］侯緒鳳，侯劍英，唐其鳳.重組人紅細胞生成素新制劑及其穩(wěn)定性研究［J］.微生物學雜志，2003，23（1）：15-17.

［13］Bhavil Narola AS，Singh M，Mitra PR，et al.A validated reverse phase HPLC method for the determination of disodium EDTA in meropenem drug substance with uv-detection using precolumn derivatization technique［J］.Anal Chem Insights，2011，6：7-13.

［14］李增禮，周樂春，趙 輝，等.高效液相色譜法測定重組人干擾素α-2b注射液中乙二胺四乙酸二鈉含量［J］.生物技術通訊，2012，23（3）：419-422.

Study on Stability of Recombinant Human Interferon α2b Injection

NI Xiao-yan1，2，WANG Rong-hai2，3，SONG Li-hua2，3，et al
（1.Anhui University of Chinese Medicine，Hefei，Anhui 230031，China；2.Anhui Anke Biotechnology （Group）Co.，Ltd.，Hefei，Anhui 230088，China，3.Anhui Biological Institute，Hefei，Anhui 230088，China）

Objective To study the stability of recombinant human interferon α2b injection.Methods According to the methods of Ch.P for testing，the protein purity of interferon were determined by HPLC.The stability of the samples were tested by strong-light，shaking，freeze thaw，accelerating experiment and prolonged low-temperature storage.Results After being exposured to repeated freezing and thawing 8 times and accelerating test for 3 months in 37℃，interferon potency was reduced to less than 80%of the theoretical value，but on other experiments，it was rather stable.Conclusion This injection should be kept away from high light and may be stored for 2 years at 2～8℃.

recombinant human interferon α2b injection；stability；serum free formula

10.3969／j.issn.1009-6469.2014.03.008

2013-11-21，

2014-02-08）

國家“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項（No 2011ZX09202-301-02）

倪曉燕，女，碩士研究生

宋禮華，男，研究員，博士生導師，研究方向：生物技術領域的研究、產(chǎn)業(yè)化開發(fā)，E-mail：songlh＠ankebio.com