丁曉明 徐寶山 伍耀宏 許海委 楊 強(qiáng)馬信龍 張春秋李秀蘭 張 揚(yáng)

細(xì)胞與分子生物學(xué)

PKH26熒光標(biāo)記牛尾髓核細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究

丁曉明1徐寶山2△伍耀宏1許海委2楊 強(qiáng)2馬信龍2張春秋3李秀蘭2張 揚(yáng)2

目的 探討PKH26熒光標(biāo)記在牛尾髓核細(xì)胞的應(yīng)用，為髓核組織工程的體內(nèi)研究提供可示蹤的種子細(xì)胞。方法從牛尾椎間盤中分離髓核組織，通過酶消化法獲取原代細(xì)胞，倒置顯微鏡下觀察，P1代髓核細(xì)胞進(jìn)行番紅O、甲苯胺藍(lán)和Ⅱ型膠原免疫細(xì)胞化學(xué)染色，對P1代髓核細(xì)胞進(jìn)行PKH26熒光染料標(biāo)記，并對標(biāo)記后細(xì)胞的活性、熒光強(qiáng)度（0、14、28 d）、增殖特性及基因表達(dá)進(jìn)行評估。結(jié)果分離得到的髓核細(xì)胞數(shù)為（1.56±0.35）×106/g，倒置顯微鏡下，原代細(xì)胞培養(yǎng)4 d開始貼壁，細(xì)胞成群生長，14 d鋪滿瓶底，原代細(xì)胞、P1代細(xì)胞均呈類軟骨樣細(xì)胞形態(tài)；P1代髓核細(xì)胞甲苯胺藍(lán)染色異染、番紅O染色和Ⅱ型膠原免疫細(xì)胞化學(xué)染色陽性；PKH26標(biāo)記前后細(xì)胞活性均在95％以上，1、14、28 d呈遞減趨勢，但28 d時細(xì)胞仍可檢測出較強(qiáng)的熒光，標(biāo)記后的細(xì)胞增殖及基因表達(dá)（Ⅰ、Ⅱ型膠原及聚集蛋白聚糖）與標(biāo)記前的細(xì)胞相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)論牛尾髓核組織中可以分離出數(shù)量滿意的髓核細(xì)胞，且具有軟骨樣細(xì)胞的表型，可以用作種子細(xì)胞；PKH26標(biāo)記后的髓核細(xì)胞無生物學(xué)特性的變化，可以用作髓核細(xì)胞體內(nèi)研究的示蹤染料。

組織工程；椎間盤；牛尾；髓核細(xì)胞；PKH26

椎間盤退變引起的下腰痛是勞動力喪失的主要原因之一，嚴(yán)重者常采用手術(shù)治療[1],但目前的治療措施未能從根本上重建正常的椎間盤結(jié)構(gòu)和功能。近年來，組織工程椎間盤作為一種生物治療方法引起廣泛關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn)椎間盤的退變起源于髓核，目前組織工程的研究也主要集中在髓核組織工程上，并取得了巨大進(jìn)展[2]。種子細(xì)胞是組織工程的重要環(huán)節(jié)，用于髓核組織工程的種子細(xì)胞主要有干細(xì)胞、髓核細(xì)胞、軟骨細(xì)胞，其中干細(xì)胞是最具應(yīng)用前景的種子細(xì)胞[3]，但干細(xì)胞誘導(dǎo)條件和誘導(dǎo)后細(xì)胞的鑒定方法尚不成熟，因此常用的種子細(xì)胞仍是髓核細(xì)胞[4]。牛尾髓核細(xì)胞具有取材方便、經(jīng)濟(jì)廉價、細(xì)胞表型良好等特點(diǎn)，為髓核組織工程提供了新的細(xì)胞來源。本實(shí)驗(yàn)對髓核細(xì)胞進(jìn)行PKH26熒光標(biāo)記，為進(jìn)一步的種子細(xì)胞體內(nèi)示蹤提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 組織來源、主要試劑及儀器 新鮮牛尾。DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清（GIBCO公司，美國）；乙二胺乙酸二鈉（EDTA）、胰蛋白酶、四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT）、兔抗牛Ⅱ型膠原抗體（Abcam公司，英國）；生物素化山羊抗兔IgG（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）；PKH26紅色熒光細(xì)胞鏈接Mini試劑盒（Sigma公司，美國）。CO2培養(yǎng)箱（Hera-cell公司，德國）；恒溫?fù)u床（Heidolph公司，德國）；倒置顯微鏡、熒光顯微鏡（OLYMPUS公司，日本）。

1.2 髓核細(xì)胞分離 取剛宰殺的牛尾（雄性，3歲齡），簡單消毒后送至實(shí)驗(yàn)室。無菌環(huán)境下分離出脊柱和牛尾椎間盤，取出髓核，清除其他組織，用含10萬U/L青霉素的Hanks液漂洗2遍，剪碎，加入濃度為0.2％的Ⅱ型膠原酶，與髓核組織以3∶1體積充分混合，在37℃、220 r/min搖床中消化4 h，至髓核組織基本消化完全，200目濾網(wǎng)過濾，收集細(xì)胞懸液，細(xì)胞計數(shù)和臺盼藍(lán)染色檢測活性，1 000 r/min離心7 min，棄上清，用含10％FBS的高糖DMEM重懸細(xì)胞沉淀，調(diào)整細(xì)胞密度為1×105/mL，接種至培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)液為含10％胎牛血清（FBS）的高糖DMEM，置于37℃、5％(V/V)CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每2 d換液1次，倒置熒光顯微鏡觀察細(xì)胞生長情況，待細(xì)胞融合至80％左右，消化傳代，P1代細(xì)胞制成懸液備用。

1.3 髓核細(xì)胞鑒定 將P1代細(xì)胞懸液調(diào)整至濃度1×104/mL，接種至含有蓋玻片的24孔板中進(jìn)行爬片，48 h后取出，多聚甲醛固定20 min，PBS緩沖液漂洗3遍，甲苯胺藍(lán)、番紅O染液常溫下染色15～20 min，風(fēng)干，中性樹脂封片，顯微鏡下觀察；按照試劑盒操作，SABC法進(jìn)行Ⅱ型膠原免疫組織化學(xué)染色，顯微鏡下觀察。

1.4 PKH26熒光染料標(biāo)記 胰酶和EDTA常規(guī)消化髓核細(xì)胞，用不含血清的DMEM培養(yǎng)基洗滌，1 000 r/min離心5 min，棄上清，重復(fù)2次，細(xì)胞沉淀用1 mL Diluent C溶液重懸成單個細(xì)胞，將其與1 mL濃度為4×10-6mol/L的PKH26染料混勻，室溫反應(yīng)5 min，加入2 mL血清終止標(biāo)記反應(yīng)，1 000 r/min離心10 min，去上清，加入完全培養(yǎng)基洗滌3次，1 000 r/min離心5 min，棄上清。用含10％FBS的高糖DMEM培養(yǎng)基重懸至所需細(xì)胞濃度1×107/mL，涂片，臺盼藍(lán)染色，觀察細(xì)胞活性，熒光顯微鏡下觀察熒光標(biāo)記強(qiáng)度（1 d、14 d、28 d）。

1.5 PKH26標(biāo)記細(xì)胞增殖活性測定 MTT檢測標(biāo)記前后的髓核細(xì)胞生長曲線。取PKH26標(biāo)記前后的P1代髓核細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，將1 mL濃度為1.0×104/mL的細(xì)胞懸液接種到24孔板上，連續(xù)培養(yǎng)7 d，MTT法檢測對髓核細(xì)胞增殖活性的影響。每天操作如下：每組樣本取3孔，每孔加入100μL MTT溶液，37℃下繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄去培養(yǎng)液，每孔加入500μL DMSO，置搖床上低速振蕩10 min后移入96孔板的3個孔中，每孔100 μL，96孔板在酶聯(lián)免疫檢測儀中570 nm測定光密度（OD）值。根據(jù)OD值和時間點(diǎn)制作生長曲線。

1.6 PKH26標(biāo)記細(xì)胞基因表達(dá)測定 實(shí)時熒光定量PCR檢測Ⅰ、Ⅱ型膠原及聚集蛋白聚糖（Aggrecan）基因表達(dá)。收集標(biāo)記前后的髓核細(xì)胞，Trizol法提取總RNA，采用M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA，采用SYBR Premix DimerEvaser建立反應(yīng)體系，分別擴(kuò)增Ⅰ、Ⅱ型膠原和Aggrecan，以β-actin作為內(nèi)參。實(shí)驗(yàn)采用Primier 5.0設(shè)計引物序列，由北京諾賽基因組研究中心合成。引物序列：β-actin上游5′-AGGTTGGCTCTGACTGT-3′，下游5′-TCTCCTTAATGTCACGCACG-3′；Ⅰ型膠原上游5′-AGGGAGTTTACAGGAAGCAGACA-3′，下游5′-CGAATACAAAACCACCAAGACC-3′；Ⅱ型膠原上游5′-TTCAGCTATGGAGATGACAATC-3′，下 游 5′-AGAGT CCTAGAGTGACTGAG-3′；Aggrecan上游 5′-GAGATGGAGGGTGAGGTC-3′，下游5′-ACGCTGCCTCGGGCTTC-3′。將各樣本放入ABI PRIS M?7500熒光定量PCR儀，按下列條件擴(kuò)增：95℃、5 min；95℃、15 s，60℃、60 s，45個循環(huán)。以β-actin作內(nèi)參照，用LightCycler Software Ver.4.0軟件分析目的基因的相對表達(dá)水平。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法 用SPSS 13.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 髓核細(xì)胞分離及鑒定結(jié)果 從牛尾髓核組織中分離的髓核細(xì)胞數(shù)量為（1.56±0.35）×106/g，細(xì)胞活性為95％以上，牛尾髓核原代細(xì)胞4 d開始貼壁，7 d可見細(xì)胞聚集成群生長，14 d長滿瓶底，胞漿飽滿，細(xì)胞呈卵圓形或短梭形，類軟骨樣細(xì)胞形態(tài)，見圖1。P1代細(xì)胞形態(tài)與原代細(xì)胞相同，呈類軟骨樣細(xì)胞形態(tài)，見圖2。細(xì)胞番紅O和甲苯胺藍(lán)染色陽性，Ⅱ型膠原免疫細(xì)胞化學(xué)陽性，見圖3。

2.2 髓核細(xì)胞PKH26標(biāo)記 髓核細(xì)胞標(biāo)記后，臺盼藍(lán)染色標(biāo)記后細(xì)胞活性仍能保持95％以上，對細(xì)胞活性無影響，熒光顯微鏡下細(xì)胞呈紅色熒光，熒光強(qiáng)烈且分布均勻，1 d、14 d、28 d熒光呈減弱趨勢，但28 d時仍可觀察到較強(qiáng)熒光，見圖4。MTT檢測結(jié)果證明PKH26標(biāo)記前后髓核細(xì)胞各增殖時間點(diǎn)的OD值無明顯的差異，見表1。PKH26標(biāo)記前后髓核細(xì)胞Ⅰ型膠原、Ⅱ型膠原、Aggrecan基因表達(dá)相對定量比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（t分別為2.671、1.021、0.870，均P＞0.05），見圖5。

Fig.1 Primary nucleus pulposus cells(inverted phase contrast microscope，×100)圖1 原代髓核細(xì)胞（倒置相差顯微鏡，×100）

Fig.2 P1 generation of nucleus pulposus cells(inverted phase contrast microscope，×100)圖2 P1代髓核細(xì)胞（倒置相差顯微鏡，×100）

Tab.1 Comparison of the proliferations of nucleus pulposus cells before and after PKH26 labeling表1 PKH標(biāo)記前后髓核細(xì)胞增殖情況比較（n=3，±s）

Tab.1 Comparison of the proliferations of nucleus pulposus cells before and after PKH26 labeling表1 PKH標(biāo)記前后髓核細(xì)胞增殖情況比較（n=3，±s）

均P＞0.05

組別PKH26標(biāo)記組未標(biāo)記組t 1 d 0.27±0.06 0.24±0.05 0.663 2 d 0.71±0.11 0.63±0.08 1.019 3 d 1.03±0.10 1.19±0.13 1.690 4 d 1.79±0.09 1.70±0.18 0.775組別PKH26標(biāo)記組未標(biāo)記組t 7 d 1.97±0.24 1.89±0.27 0.384 5 d 2.01±0.17 1.92±0.14 0.708 6 d 1.95±0.21 2.10±0.15 1.007

Fig.5 Comparison of gene expressions of nucleus pulposus cells before and after PKH26 labeling圖5 髓核細(xì)胞PKH26標(biāo)記前后基因表達(dá)水平比較

3 討論

3.1 髓核細(xì)胞來源 髓核細(xì)胞作為種子細(xì)胞，目前主要來源于患者手術(shù)切除組織和兔[4]、鼠[5]等小動物。而小動物存在以下不足：首先，獲取髓核組織量少，不能得到理想的種子細(xì)胞數(shù)目；其次，小動物與人的親緣關(guān)系不如大型動物；用于研究的人髓核細(xì)胞都來源于患者手術(shù)中切除的退變組織，分離的細(xì)胞沒有正常髓核細(xì)胞的表型，不能滿足研究的需要[6]。牛尾取材經(jīng)濟(jì)、方便，能一次性獲取大量的髓核組織。Roughley等[7]從成年牛尾中獲得細(xì)胞數(shù)為3×106/g。Halloran等[8]從6月齡牛尾中提取的細(xì)胞數(shù)約為7.0×106/g。不同實(shí)驗(yàn)者獲取的種子細(xì)胞數(shù)目存在較大差異，這主要與牛的年齡有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)獲取的種子細(xì)胞數(shù)在文獻(xiàn)所報道的范圍內(nèi)，能夠滿足種子細(xì)胞的數(shù)量要求。目前對于髓核細(xì)胞的鑒定沒有統(tǒng)一的方法，但由于髓核細(xì)胞是一種軟骨樣細(xì)胞，能夠分泌蛋白多糖和Ⅱ型膠原，通過這兩個表型特點(diǎn)來初步鑒定髓核細(xì)胞，并且染色均為陽性，說明牛尾髓核組織可以獲得數(shù)量和表型均滿意的髓核種子細(xì)胞。

3.2 熒光標(biāo)記技術(shù) 目前常用的細(xì)胞標(biāo)記染料包括Brdu[9]、CFSE[10]、綠色熒光蛋白[11]、PKH26[12]、放射性同位素標(biāo)記[13]等。其中，PKH26是一種親脂性的熒光染料，熒光顯微鏡下呈現(xiàn)紅色熒光，能夠不可逆地結(jié)合細(xì)胞膜，在合適的濃度下不會影響細(xì)胞活力，標(biāo)記物可以隨著種子細(xì)胞的分裂而均勻地分配給兩個子細(xì)胞，同時熒光強(qiáng)度減半，是一種簡便的體內(nèi)細(xì)胞示蹤染料，在體內(nèi)熒光強(qiáng)度可以維持4個月，已成功用于上皮細(xì)胞[12]、骨髓基質(zhì)干細(xì)胞[14]等的熒光標(biāo)記。

3.3 PKH標(biāo)記牛尾髓核細(xì)胞 本實(shí)驗(yàn)PKH26標(biāo)記采用Sigma公司推薦的標(biāo)記濃度（2 μmol/L）成功對牛尾髓核細(xì)胞進(jìn)行了標(biāo)記，熒光顯微鏡下強(qiáng)度滿意，熒光標(biāo)記均勻，且標(biāo)記后的細(xì)胞活性基本沒有影響（2 μmol/L濃度下，標(biāo)記時間一般在2～3 min，延長時間細(xì)胞熒光強(qiáng)度沒有明顯增強(qiáng)，而細(xì)胞活性會受到影響），細(xì)胞標(biāo)記前后MTT增殖檢測、同一基因相對表達(dá)量比較也無明顯差異。傳代培養(yǎng)14 d、28 d細(xì)胞熒光逐漸減弱，但是仍可檢測出，這說明PKH26標(biāo)記的細(xì)胞體內(nèi)可以至少維持1個月，這為髓核組織工程體內(nèi)研究提供了新的研究方法，可以對種子細(xì)胞進(jìn)行示蹤，根據(jù)熒光定位區(qū)分移植細(xì)胞和宿主細(xì)胞，結(jié)合免疫熒光可以更準(zhǔn)確地對種子細(xì)胞體內(nèi)生物學(xué)功能進(jìn)行評估。

綜上，從牛尾髓核組織可以獲得數(shù)量和表型均滿意的髓核種子細(xì)胞，經(jīng)PKH26標(biāo)記后，牛尾髓核細(xì)胞形態(tài)、表型、增殖及蛋白表達(dá)無影響，而且PKH26標(biāo)記技術(shù)操作簡單，標(biāo)記迅速、持續(xù)時間長，可以用作組織工程椎間盤種子細(xì)胞的示蹤研究。

Fig.3 The staining for nucleus pulposus cells of P1(inverted phase contrast microscope，×200)圖3 P1代髓核細(xì)胞鑒定染色（倒置相差顯微鏡，×200）

Fig.4 PKH26 labeled nucleus pulposus cells(fluorescence microscope，×100)圖4 PKH26標(biāo)記的髓核細(xì)胞（熒光顯微鏡，×100）

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（2014-04-28收稿 2014-05-23修回）

（本文編輯 李鵬）

An Experimental Study on Bovine Nucleus Pulposus Cells Labelled with PKH26 in Vitro

DING Xiaoming1，XU Baoshan2△，WU Yaohong1，XU Haiwei2，YANG Qiang2，MA Xinlong2，ZHANG Chunqiu3，LI Xiulan2，ZHANG Yang2
1 Tianjin Medical University,Tianjin 300070,China；2 Tianjin Hospital；3 Tianjin University of Technology△

E-mail：xubaoshan99@126.com

ObjectiveTo investigate the application of PKH26 fluorescent labeling on nucleus pulposus cells isolated from bovine coccyx disc,and to provide nucleus pulposus tissue engineering with traceable nucleus pulposus cells by PKH26 fluorescence labelling.MethodsNucleus pulposus primary cells were isolated from the nucleus pulposus tissue detached from bovine coccyx disc by enzymatic digestion,and observed under the inverted microscope.Safranin O,toluidine blue and typeⅡcollagen immunocytochemistry methods used to stain for passage one generation cells.Nucleus pulposus cells were labeled with PKH26 fluorescence in accordance with the instructions.The cell activity,fluorescence intensity at d0,d14 and d28 of culture,characteristics of proliferation and the expression of gene in labeled cells were assessed.ResultsIsolated nucleus pulposus cells amounted to(1.56±0.35)×106/g.Under the inverted microscope,primary cells adhered at the 4 th day of culture,grew in groups,and covered the bottom of culture flask at the 13 th day.Both primary cells and the P1 generation cells were chondrocyte-like morphology.The staining of safranin O,toluidine blue and typeⅡcollagen immunocytochemistry for P1 generation of nucleus pulposus cells showed positive results.The cell activity before and after PKH26 labeling showed more than 95％,and the fluorescence intensity at d0,d14 and d28 performed a decreasing trend, but still showed detect strong fluorescence at d28.There were no significant differences in proliferation and the expression of gene(collagen typeⅠandⅡ,aggrecan)before and after cell labeling(P＞0.05).ConclusionAs the seed cells of tissue engineering,nucleus pulposus cells isolated from bovine coccyx can reach a satisfactory number and maintain cartilage-like phenotype,and no changes shown in the biological characteristics after labeling.PKH26 labeled nucleus pulposus cells are suitable for the traceable cells in vivo study.

tissue engineering；intervertebral disk；bovine coccyx;nucleus pulposus cells;PKH26

R329-33，R349.89

A

10.3969/j.issn.0253-9896.2014.09.001

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81272046,31300798,31000432）；中國博士后科學(xué)基金項(xiàng)目（2011M500530,2012T50221)；天津市衛(wèi)生局科技基金（2013KR16）

1天津醫(yī)科大學(xué)研究生院（郵編300070）；2天津市天津醫(yī)院；3天津理工大學(xué)

△通訊作者 E-mail：xubaoshan99@126.com