杜志強(qiáng)　林濤

摘要：通過重組Lv-SWD蛋白的表達(dá)與純化，進(jìn)行多克隆抗體的制備與細(xì)菌結(jié)合試驗，研究凡納對蝦（Litopenaeus vannamei）重組SWD蛋白在先天免疫系統(tǒng)中的功能。結(jié)果表明，Lv-SWD的預(yù)測分子質(zhì)量為12.9 ku，實際大小與理論值相符合。重組Lv-SWD蛋白作為抗原制備的多克隆抗體，可以較好地識別蛋白質(zhì)本身，且可以直接結(jié)合巨大芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、綠膿桿菌（Pseudomonas aeruginosa）以及弧菌（Vibrio）4種細(xì)菌。

關(guān)鍵詞：凡納對蝦（Litopenaeus vannamei）；SWD抗菌肽；多克隆抗體制備；細(xì)菌結(jié)合試驗

中圖分類號：Q786 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2014）05-1189-02

目前，對于抗菌肽分子在先天免疫系統(tǒng)中發(fā)揮作用的機(jī)理還不是十分清楚，根據(jù)目前的研究結(jié)果來看，抗菌肽分子在發(fā)揮抑菌功能的過程中主要存在兩種模式，一種是直接與細(xì)菌作用將其瓦解，另一種是發(fā)揮蛋白酶活性抑制劑作用來將細(xì)菌除掉[1]。本研究以凡納對蝦（Litopenaeus vannamei）重組Lv-SWD蛋白作為研究對象，通過蛋白質(zhì)表達(dá)純化以及多克隆抗體的制備，利用細(xì)菌結(jié)合試驗來研究Lv-SWD的細(xì)菌結(jié)合作用，進(jìn)一步豐富無脊椎動物先天免疫系統(tǒng)關(guān)于抗菌肽的基本理論。

1 材料與方法

1.1 材料

表達(dá)菌株是含有pET-28a-Lv-SWD重組子的大腸桿菌表達(dá)菌株。細(xì)菌結(jié)合試驗的目標(biāo)菌株分別是2種革蘭氏陽性細(xì)菌（金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus、巨大芽孢桿菌Bacillus subtilis）和2種革蘭氏陰性細(xì)菌（綠膿桿菌Pseudomonas aeruginosa和弧菌Vibrio）。制備多克隆抗體需要的家兔為包頭市花苑小動物市場購買的普通長耳白兔。

1.2 方法

1.2.1 目的蛋白的表達(dá)純化 對構(gòu)建的重組Lv-SWD蛋白的重組表達(dá)菌株進(jìn)行IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，離心收集菌體進(jìn)行超聲波破碎，并且通過蛋白質(zhì)電泳試驗分析破碎后的上清液與包涵體沉淀中目的蛋白質(zhì)的存在情況。對于存在于破碎后上清液中的目的蛋白質(zhì)，可以直接利用His-tag鎳柱進(jìn)行親和純化；對于存在于包涵體中的目的蛋白質(zhì)，要進(jìn)行變性后的透析處理，才能進(jìn)行親和純化[2]。

1.2.2 多克隆抗體的制備與檢測 將親和純化后的目的重組蛋白質(zhì)進(jìn)行SDS-PAGE試驗，檢測蛋白質(zhì)的純度，利用Bradford法檢測目的重組蛋白的濃度；之后將目的蛋白質(zhì)作為抗原免疫家兔，進(jìn)行多克隆抗體的制備；家兔免疫共需要4～5次，每次注射間隔7～10 d，并且按照皮下多點注射的原則每次至少注射200 ？滋g重組蛋白。首次免疫將蛋白質(zhì)抗原與弗氏完全佐劑按1∶1（V∶V，下同）進(jìn)行充分混合后注射，第二、第三次注射與弗氏不完全佐劑進(jìn)行充分混合后注射，從第四次免疫開始直接注射蛋白質(zhì)溶液[3]。利用Western Blot方法進(jìn)行多克隆抗體的檢測。

1.2.3 重組蛋白質(zhì)的細(xì)菌結(jié)合試驗 將進(jìn)行細(xì)菌結(jié)合試驗的目的細(xì)菌菌株進(jìn)行過夜培養(yǎng)，第二天低速離心收集細(xì)菌菌體，用500 ？滋L 1×PBS緩沖液懸起，加入經(jīng)過1×PBS緩沖液透析的500 ？滋L目的蛋白質(zhì)溶液（1 mg/mL），室溫條件下?lián)u床孵育1 h；低速離心后用500 ？滋L 1×PBS緩沖液洗滌5次。之后用7% SDS溶液200 ？滋L孵育菌體，沉淀10 min，離心后收集最后的菌體沉淀和7%的SDS洗脫液。將第五次的1×PBS洗脫液、7%的SDS洗脫液、最后的菌體沉淀作為樣品進(jìn)行SDS-PAGE，轉(zhuǎn)膜后利用Western Blot方法檢測結(jié)合試驗的效果，使用的抗體是重組Lv-SWD蛋白制備的多克隆抗體[4]。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組Lv-SWD蛋白的純化與多克隆抗體的檢測結(jié)果

大腸桿菌表達(dá)菌株經(jīng)過IPTG誘導(dǎo)能夠正確表達(dá)重組Lv-SWD蛋白，理論分子量為12.9 ku，由圖1可見，純化后蛋白條帶的大小接近14.3 ku，說明重組蛋白的大小與理論預(yù)測值相符。Western Blot分析結(jié)果（圖1）表明，重組Lv-SWD蛋白刺激家兔產(chǎn)生的多克隆抗體能夠較好的識別蛋白質(zhì)本身。

2.2 細(xì)菌結(jié)合試驗結(jié)果

細(xì)菌結(jié)合試驗結(jié)果（圖2）表明，利用重組Lv-SWD蛋白制備的多克隆抗體識別醋酸纖維素薄膜后，4種細(xì)菌的菌體沉淀處都有明顯的條帶出現(xiàn)，說明巨大芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌以及弧菌都能較好的結(jié)合重組Lv-SWD蛋白。

3 小結(jié)與討論

目前，對于抗菌肽分子的研究比較深入，尤其是在甲殼類動物中的研究成果較多。在中國明對蝦、淡水小龍蝦、克氏原鰲蝦、南美白對蝦、斑節(jié)對蝦等動物中分別發(fā)現(xiàn)了甲殼肽、溶菌酶、抗脂多糖因子、對蝦素等免疫效應(yīng)分子[5]，這些分子多數(shù)具有一定的先天免疫相關(guān)功能，包括抗菌活性、結(jié)合細(xì)菌活性、蛋白酶活性抑制作用等。通過研究這些分子的結(jié)構(gòu)特征發(fā)現(xiàn)，一般情況下無脊椎動物先天免疫相關(guān)的抗菌肽分子具有廣泛的多樣性，包括結(jié)構(gòu)多樣性與功能多樣性[6]。在結(jié)構(gòu)方面，抗菌肽分子一般都包括一個典型的結(jié)構(gòu)域，例如WAP結(jié)構(gòu)域、對蝦素結(jié)構(gòu)域、溶菌酶結(jié)構(gòu)域，這些結(jié)構(gòu)域的最重要特點就是具有成對出現(xiàn)的半胱氨酸殘基，數(shù)目一般在8個以上[7]。

為了進(jìn)一步研究抗菌肽分子的結(jié)構(gòu)與功能之間的聯(lián)系，本研究選擇了凡納對蝦的SWD分子進(jìn)行了系統(tǒng)研究。凡納對蝦的SWD分子中存在一個單獨的WAP結(jié)構(gòu)域，這個結(jié)構(gòu)域主要由8個半胱氨酸殘基組成。通過結(jié)構(gòu)預(yù)測發(fā)現(xiàn)，這8個半胱氨酸殘基可以形成4對二硫鍵，本研究在整個分子中形成一個球狀的實體結(jié)構(gòu)和一個疏水的空穴。通過大腸桿菌原核表達(dá)，利用重組蛋白作為抗原，制備了多克隆抗體。從而對分子的細(xì)菌結(jié)合功能進(jìn)行了研究，結(jié)合此前進(jìn)行的蛋白酶活性抑制試驗，筆者發(fā)現(xiàn)重組的Lv-SWD蛋白具有抑制分泌型蛋白酶活性的作用，也存在直接結(jié)合細(xì)菌的功能，因此，推測在先天免疫系統(tǒng)中，Lv-SWD蛋白是一個重要的免疫效應(yīng)分子，在對抗細(xì)菌的入侵過程中應(yīng)該發(fā)揮著重要的功能。

參考文獻(xiàn)：

[1] DU Z Q，REN Q，ZHAO X F，et al.A double WAP domain （DWD）-containing protein with proteinase inhibitory activity in Chinese white shrimp， Fenneropenaeus chinensis[J]. Comparative Biochemistry and Physiology B： Biochemistry and Molecular Biology，2009，154（2）：203-210.

[2] DU Z Q，LI X C，WANG Z H，et al.A single WAP domain （SWD）-containing protein with antipathogenic relevance in red swamp crayfish， Procambarus clarkii[J]. Fish & Shellfish Immunology，2010，28（1）：134-142.

[3] SUN C，DU X J， XU W T，et al. Molecular cloning and characterization of three crustins from the Chinese white shrimp， Fenneropenaeus chinensis[J]. Fish & Shellfish Immunology，2010， 28（4）：517-524.

[4] LI X C，DU Z Q，LAN J F，et al. A novel pathogen-binding gC1qR homolog， FcgC1qR， in the Chinese white shrimp， Fenneropenaeus chinensis[J]. Dev Comp Immunol，2012，36（2）：400-407.

[5] KRUSONG K， POOLPIPAT P， SUPUNGUL P， et al. A comparative study of antimicrobial properties of crustinPm1 and crustinPm7 from the black tiger shrimp Penaeus monodon[J]. Dev Comp Immunol，2012，36（1）：208-215.

[6] MU C，ZHENG P，ZHAO J，et al. A novel type III crustin （CrusEs2）identified from Chinese mitten crab Eriocheir sinensis[J].Fish Shellfish Immunol，2011，31（1）：142-147.

[7] SMITH V J. Phylogeny of whey acidic protein（WAP）four-disulfide core proteins and their role in lower vertebrates and invertebrates[J]. Biochem Soc Trans，2011，39（5）：1403-1408.