鄒蕊　馬貴

摘要：糖類的研究已經(jīng)成為生物及化學(xué)領(lǐng)域一個(gè)新的熱點(diǎn)。凝集素與糖類之間的作用是生命活動(dòng)中一個(gè)重要的部分。試驗(yàn)設(shè)計(jì)了一種比較簡(jiǎn)單的D-甘露糖電化學(xué)阻抗傳感器，以刀豆凝集素為分子識(shí)別物質(zhì)，共價(jià)鍵合法將刀豆凝集素固定到金圓盤電極的表面，用電化學(xué)阻抗法進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明，以

[Fe（CN）6]3-/4-氧化還原電對(duì)作為探針，電子轉(zhuǎn)移阻抗變化值與D-甘露糖的濃度之間呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

關(guān)鍵詞：電化學(xué)傳感器；阻抗；刀豆凝集素；D-甘露糖

中圖分類號(hào)：TP212.2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2014）05-1136-03

細(xì)胞表面的糖化合物不僅在正常細(xì)胞的識(shí)別、細(xì)胞黏附和細(xì)胞間信號(hào)傳導(dǎo)等方面具有重要作用，而且在細(xì)胞病變、病原感染等研究方面亦有重要意義。因此，研究生物體內(nèi)糖類物質(zhì)的變化是一個(gè)非常重要的問題。近幾年來，凝集素與糖類物質(zhì)之間特異性的相互作用引起了人們廣泛的關(guān)注。利用凝集素結(jié)合特性可以提供糖鏈末端結(jié)構(gòu)的信息，且具有特異、敏感、快速的特點(diǎn)[1]。本試驗(yàn)設(shè)計(jì)了以刀豆凝集素為分子識(shí)別物質(zhì)，測(cè)定D-甘露糖的電化學(xué)交流阻抗生物傳感器。電化學(xué)交流阻抗技術(shù)是一種對(duì)電極界面性質(zhì)變化十分敏感而便捷的檢測(cè)技術(shù)，能夠提供有關(guān)電極界面電子傳遞電阻，雙電層電容等多種界面參數(shù)的大量信息，而且是一種非標(biāo)記的技術(shù)，具有簡(jiǎn)單且無需標(biāo)記等優(yōu)點(diǎn)[2]。試驗(yàn)利用刀豆凝集素與甘露糖的特異性相互作用，將半胱氨酸固定到電極表面之后，在N-（3-二甲氨基）-N-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（EDC）和N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）的作用下，將半胱氨酸的羧基轉(zhuǎn)化為酰基[3]，然后與刀豆凝集素的氨基形成酰氨鍵，從而將刀豆凝集素固定到電極表面，以檢測(cè)甘露糖。該傳感器電子轉(zhuǎn)移阻抗改變值與D-甘露糖的濃度之間呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，為D-甘露糖的檢測(cè)提供了新思路。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

刀豆凝集素A（Concanavalin A，ConA）、N-（3-二甲氨基丙基）-N′-乙基碳二亞胺鹽酸鹽[N-（3-Dimethylaminopropyl）-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride，EDC]購(gòu)自Sigma公司；D-甘露糖 （C6H12O6）、半胱氨酸（Cysteine，CS）購(gòu)自Alfa Aesar公司。N-羥基琥珀酰亞胺（N-hydroxysuccimide，NHS）購(gòu)自上海麗珠東風(fēng)生物技術(shù)有限公司。緩沖液為0.10 mol/L磷酸緩沖溶液（PBS，pH 7.40）-10 mmol/L KCl。用0.10 mol/L PBS（pH 7.40）來配制5 mmol/L K3[Fe（CN）6]-5 mmol/L K4[Fe（CN）6]檢測(cè)溶液。

NHS和EDC均使用0.10 mol/L PBS-10 mol/L KCl （pH 7.40）配制。其他試劑均為分析純，試驗(yàn)所用溶液均用超純水配制。

刀豆凝集素的活化[4]：刀豆凝集素使用前用0.1 mmol/ L的Ca2+、Mn2+活化6 h。

電化學(xué)分析系統(tǒng)：CHI 660電化學(xué)工作站（上海辰華儀器有限公司）。電極為三電極系統(tǒng)，工作電極為金圓盤電極（Φ=2.0 mm），對(duì)極為鉑絲，參比電極為銀/氯化銀電極（Ag/AgCl 飽和KCl）。

1.2 金圓盤電極預(yù)處理

將金電極用0.03 ？滋m Al2O3溶膠研磨，然后用水沖洗；再將沖洗后的金電極在0.10 mol /L H2SO4溶液中在電位范圍0～1.6 V，循環(huán)伏安掃描直到得到標(biāo)準(zhǔn)金的還原峰，用二次水沖洗干凈備用[5]。

1.3 生物傳感器的制備

將預(yù)處理好的金電極浸入0.02 mol/L半胱胺酸溶液中浸泡16 h，然后用水沖洗，使金電極表面形成帶正電的自組裝膜[1]（CS/Au），再將100 μL 40 mmol/L的EDC和10 mmol/ L的NHS的混合溶液滴加在CS/金電極上，使金電極表面的半胱胺酸得到活化，室溫下靜置1 h[6]，然后用水沖洗（EDC-NHS/CS/ Au）；再將活化后的CS/金電極在ConA溶液中浸泡1 h，利用活化后的CS與帶氨基的ConA共價(jià)鍵合結(jié)合，將ConA共價(jià)鍵合法固定在電極表面制備成傳感器（ConA/EDC-NHS/CS/ Au），如圖1所示。待用。

2 結(jié)果與分析

2.1 循環(huán)伏安法表征

圖2為傳感器制備過程中，不同修飾電極在5 mmol /L K3[Fe（CN）6]-5 mmol/L K4[Fe（CN）6]中的循環(huán)伏安圖。從圖2中可以看出，裸金電極的氧化還原峰電位差△E=0.083 1 V，當(dāng)在金電極自組裝了CS后，EDC+NHS/CS/Au上固定了刀豆凝集素之后，[Fe（CN）6]3-/4-平衡電對(duì)的氧化峰電流降低，原因是刀豆凝集素的等電點(diǎn)pI為4.5～5.0，在中性條件下（pH 7.40）會(huì)帶負(fù)電，因此，對(duì)荷負(fù)電的[Fe（CN）6]3-/4-平衡電對(duì)存在靜電排斥作用，使得氧化電流較固定有EDC+NHS/CS/Au的電極降低。當(dāng)加入D-甘露糖之后，[Fe（CN）6]3-/4-平衡電對(duì)的氧化峰電流繼續(xù)降低。這可能是由于刀豆凝集素結(jié)合D-甘露糖之后，空間位阻變大，導(dǎo)致[Fe（CN）6]3-/4-平衡電對(duì)在電極上的電子轉(zhuǎn)移受到阻礙。

2.2 交流阻抗法表征

圖3為傳感器制備過程中，不同修飾電極在5 mmol/L K3[Fe（CN）6]-5 mmol/L K4[Fe（CN）6]中的復(fù)平面阻抗圖。從圖3可以看出，EDC+NHS/CS/Au的阻抗譜幾乎為一直線，表明在此情況下，反應(yīng)是受擴(kuò)散控制的過程，平衡電對(duì)非常容易到達(dá)電極的表面發(fā)生反應(yīng)，電極上不存在阻擋電子傳遞的物質(zhì)。這說明羧基?；髱д?，吸引電子，阻抗值變小。而當(dāng)結(jié)合ConA之后，Nyquist圖上高頻區(qū)半圓增大。這一現(xiàn)象歸因于ConA本身分子比較大，電極表面的空間位阻就會(huì)變大，阻礙平衡電對(duì)向電極表面?zhèn)鬟f，使表面電子傳遞電阻Ret增大。

從不同電極的循環(huán)伏安圖及交流阻抗圖中可以看出，在ConA固定到電極的過程中，電極表面的阻抗增大，電子傳遞速度變慢，而不同濃度的甘露糖結(jié)合到電極上之后，也會(huì)引起阻抗值的變化，這表明本試驗(yàn)設(shè)計(jì)的D-甘露糖電化學(xué)交流阻抗傳感器能用于甘露糖的檢測(cè)。

2.3 傳感器的線性范圍

利用共價(jià)鍵合法制備電化學(xué)傳感器對(duì)不同濃度的D-甘露糖進(jìn)行測(cè)定。圖4為EDC+NHS/ConA/CS/金電極對(duì)不同濃度的D-甘露糖在5 mmol/L K3[Fe（CN）6]-5 mmol/LK4[Fe（CN）6]中的交流阻抗圖，內(nèi)插圖為阻抗差值與D-甘露糖濃度對(duì)數(shù)值之間的線性關(guān)系圖。從圖4中可見，EDC加NHS共價(jià)鍵和來固定刀豆凝集素的方法在甘露糖為5×10-9 mol/L至1×10-6 mol/L之間呈良好的線性關(guān)系。阻抗差值（y）與D-甘露糖的濃度（x，mol/L）在5×10-9 mol/L至1×10-6 mol/L之間也呈良好的線性關(guān)系，其線性回歸方程為y=521.5x+4 486.7，線性相關(guān)系數(shù)為0.975 7。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)通過共價(jià)鍵和的方式，將刀豆凝集素固定到金電極的表面，研制了一種簡(jiǎn)單、靈敏的測(cè)定D-甘露糖的電化學(xué)阻抗傳感器。該傳感器電子轉(zhuǎn)移阻抗改變值與D-甘露糖的濃度在5×10-9 mol/L至1×10-6 mol/L之間呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。試驗(yàn)結(jié)果表明，刀豆凝集素與甘露糖的特異性相互作用能夠應(yīng)用于對(duì)甘露糖的定量檢測(cè)，并獲得了較高的靈敏度，為D-甘露糖的檢測(cè)提供了新思路。

參考文獻(xiàn)：

[1] 黎振華，羊小海，王 青，等.伴刀豆球蛋白A/葡聚糖修飾的金納米顆粒自組裝膜增強(qiáng)信號(hào)的表面等離子體共振葡萄糖傳感器[J].化學(xué)傳感器，2002，27（1）：23-27.

[2] LI X X，SHEN L H，ZHANG C X，et al. Electrochemical impedance spectroscopy for study of aptamer-thrombin interfacial interactions[J]. Biosensors and Bioelectronics， 2008， 23（11）：1624-1630.

[3] BELLE J T， GERLACH J Q， SVROVSKY S，et al. Label-free lmpedimetric detection of glycan lectin interactions[J]. Anal Chem，2007，79（18）：6959-6964.

[4] 李揚(yáng)眉，陳志春，呂德水，等.辣根過氧化物酶活性膜結(jié)構(gòu)及生物電催化性能[J].物理化學(xué)學(xué)報(bào)，2003，19（5）：474-477.

[5] ZHANG C X，HARUYAMA T，AIZAWA M， et al.Evaluation of substituted-1，10-phenanthroline complexes of osmium as mediator for glucose oxidase of Aspergillus niger[J].Analytica Chimica Acta.，2000，408（1-2）：225-232.

[6] 郭萌萌，楊云慧，王志杰，等. 基于伴刀豆球蛋白固定過氧化物酶無介體新型生物傳感器的研制[J].分析化學(xué)，2006，34（3）：399-402.

從不同電極的循環(huán)伏安圖及交流阻抗圖中可以看出，在ConA固定到電極的過程中，電極表面的阻抗增大，電子傳遞速度變慢，而不同濃度的甘露糖結(jié)合到電極上之后，也會(huì)引起阻抗值的變化，這表明本試驗(yàn)設(shè)計(jì)的D-甘露糖電化學(xué)交流阻抗傳感器能用于甘露糖的檢測(cè)。

2.3 傳感器的線性范圍

利用共價(jià)鍵合法制備電化學(xué)傳感器對(duì)不同濃度的D-甘露糖進(jìn)行測(cè)定。圖4為EDC+NHS/ConA/CS/金電極對(duì)不同濃度的D-甘露糖在5 mmol/L K3[Fe（CN）6]-5 mmol/LK4[Fe（CN）6]中的交流阻抗圖，內(nèi)插圖為阻抗差值與D-甘露糖濃度對(duì)數(shù)值之間的線性關(guān)系圖。從圖4中可見，EDC加NHS共價(jià)鍵和來固定刀豆凝集素的方法在甘露糖為5×10-9 mol/L至1×10-6 mol/L之間呈良好的線性關(guān)系。阻抗差值（y）與D-甘露糖的濃度（x，mol/L）在5×10-9 mol/L至1×10-6 mol/L之間也呈良好的線性關(guān)系，其線性回歸方程為y=521.5x+4 486.7，線性相關(guān)系數(shù)為0.975 7。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)通過共價(jià)鍵和的方式，將刀豆凝集素固定到金電極的表面，研制了一種簡(jiǎn)單、靈敏的測(cè)定D-甘露糖的電化學(xué)阻抗傳感器。該傳感器電子轉(zhuǎn)移阻抗改變值與D-甘露糖的濃度在5×10-9 mol/L至1×10-6 mol/L之間呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。試驗(yàn)結(jié)果表明，刀豆凝集素與甘露糖的特異性相互作用能夠應(yīng)用于對(duì)甘露糖的定量檢測(cè)，并獲得了較高的靈敏度，為D-甘露糖的檢測(cè)提供了新思路。

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[6] 郭萌萌，楊云慧，王志杰，等. 基于伴刀豆球蛋白固定過氧化物酶無介體新型生物傳感器的研制[J].分析化學(xué)，2006，34（3）：399-402.

從不同電極的循環(huán)伏安圖及交流阻抗圖中可以看出，在ConA固定到電極的過程中，電極表面的阻抗增大，電子傳遞速度變慢，而不同濃度的甘露糖結(jié)合到電極上之后，也會(huì)引起阻抗值的變化，這表明本試驗(yàn)設(shè)計(jì)的D-甘露糖電化學(xué)交流阻抗傳感器能用于甘露糖的檢測(cè)。

2.3 傳感器的線性范圍

利用共價(jià)鍵合法制備電化學(xué)傳感器對(duì)不同濃度的D-甘露糖進(jìn)行測(cè)定。圖4為EDC+NHS/ConA/CS/金電極對(duì)不同濃度的D-甘露糖在5 mmol/L K3[Fe（CN）6]-5 mmol/LK4[Fe（CN）6]中的交流阻抗圖，內(nèi)插圖為阻抗差值與D-甘露糖濃度對(duì)數(shù)值之間的線性關(guān)系圖。從圖4中可見，EDC加NHS共價(jià)鍵和來固定刀豆凝集素的方法在甘露糖為5×10-9 mol/L至1×10-6 mol/L之間呈良好的線性關(guān)系。阻抗差值（y）與D-甘露糖的濃度（x，mol/L）在5×10-9 mol/L至1×10-6 mol/L之間也呈良好的線性關(guān)系，其線性回歸方程為y=521.5x+4 486.7，線性相關(guān)系數(shù)為0.975 7。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)通過共價(jià)鍵和的方式，將刀豆凝集素固定到金電極的表面，研制了一種簡(jiǎn)單、靈敏的測(cè)定D-甘露糖的電化學(xué)阻抗傳感器。該傳感器電子轉(zhuǎn)移阻抗改變值與D-甘露糖的濃度在5×10-9 mol/L至1×10-6 mol/L之間呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。試驗(yàn)結(jié)果表明，刀豆凝集素與甘露糖的特異性相互作用能夠應(yīng)用于對(duì)甘露糖的定量檢測(cè)，并獲得了較高的靈敏度，為D-甘露糖的檢測(cè)提供了新思路。

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