嵇海峰，朱艷冰，蔡慧農(nóng)，陳 峰，楊遠(yuǎn)帆，肖安風(fēng)，4

(1．集美大學(xué)生物工程學(xué)院，福建 廈門 361021;2．福建省食品微生物與酶工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 廈門 361021;3．Department of Food，Nutrition and Packaging Sciences，Clemson University，Clemson，SC 29634;4．廈門市食品與生物工程技術(shù)研究中心，福建 廈門 361021)

0 引言

柚子產(chǎn)于我國(guó)福建、江西、廣東、廣西等南方地區(qū)，具有氣味清香、口感酸甜、營(yíng)養(yǎng)豐富、藥用價(jià)值高等優(yōu)點(diǎn)[1]．福建省是柚子生產(chǎn)的重要基地，主產(chǎn)品種有漳州市平和縣的琯溪蜜柚、平和紅柚和莆田仙游縣的度尾文旦柚．目前柚子的消費(fèi)主要以鮮食為主，但隨著水果種植業(yè)的發(fā)展，柚子產(chǎn)銷矛盾日益突出，因此，開發(fā)柚汁產(chǎn)品具有重要的意義．而香氣作為柚汁的一個(gè)重要品質(zhì)，具有非常重要的研究?jī)r(jià)值．柚汁揮發(fā)性成分的定性、定量分析可以對(duì)其香氣品質(zhì)進(jìn)行有效的評(píng)價(jià)，并為優(yōu)化柚汁加工產(chǎn)品的風(fēng)味提供技術(shù)支持．目前對(duì)果汁揮發(fā)性成分的提取方法主要有液液萃取法、同時(shí)蒸餾萃取法、固相微萃取法等，其中固相微萃取具有操作簡(jiǎn)便，不需溶劑，且不存在非揮發(fā)性成分污染，樣品不需加熱，能很好地萃取出樣品原有的揮發(fā)性成分等優(yōu)點(diǎn)，因此，許多對(duì)果汁揮發(fā)性成分的研究都是利用固相微萃取進(jìn)行提取的[2－7]．對(duì)于揮發(fā)性成分的檢測(cè)技術(shù)，目前主要有氣相色譜、氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用、氣相嗅聞、核磁共振等，其中氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)可以通過與商業(yè)譜庫中的質(zhì)譜圖進(jìn)行比較，再結(jié)合氣相保留指數(shù)，就可以將未知物初步定性為一種或幾種最可能的物質(zhì)，再用標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行對(duì)照則可準(zhǔn)確定性定量，目前對(duì)揮發(fā)性成分的檢測(cè)主要應(yīng)用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù) (Gas Chromatography－Mass Spectrometer，GC－MS)[6，8]．

柚汁的香氣很大程度上取決于柚子的品種，因此研究不同品種柚汁的香氣對(duì)于柚汁飲料的互配、評(píng)價(jià)等具有重要的意義．目前國(guó)內(nèi)外對(duì)柚汁揮發(fā)性成分及香氣的研究較少，國(guó)外有研究者對(duì)葡萄柚的揮發(fā)性成分進(jìn)行了研究:Buettner等[9]鑒定了葡萄柚中的37種香氣活性物質(zhì)，其中香氣強(qiáng)度較高的成分為丁酸乙酯、1－對(duì)孟烯－8－硫醇和順式－3－己烯醛．國(guó)內(nèi)有研究者對(duì)我國(guó)的一些柑橘汁進(jìn)行了揮發(fā)性成分的分析，如喬宇[10]運(yùn)用固相微萃取和氣質(zhì)聯(lián)用儀對(duì)湖北地區(qū)的10種柑橘汁的揮發(fā)性成分進(jìn)行了研究．但對(duì)于柚汁香氣的研究較少，有關(guān)福建柚汁香氣的研究也未見報(bào)道．本文利用固相微萃取 (Solid-phase micro-extraction，SPME)結(jié)合氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀分析了福建的3種主要柚子品種的揮發(fā)性成分，并對(duì)其中的主要香氣成分進(jìn)行了分析．

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

柚子于2013年9月—2013年11月份采樣，選擇已充分成熟的柚子進(jìn)行采樣．琯溪蜜柚、平和紅柚均采自漳州市平和縣，度尾文旦柚采自莆田市仙游縣．

1.2 儀器與試劑

DS－1高速組織搗碎機(jī) (上海精科實(shí)業(yè)有限公司);日本島津氣相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用儀 (QP2010 plus);Rtx－5MS毛細(xì)管色譜柱 (60 m×0.32 mm，0.25 μm);手動(dòng)固相微萃取器、萃取頭 (50/30 μm，美國(guó) Supelco公司)．

丙酸乙酯、正戊醇、正己醛、反式－2－己烯醛、正己醇、庚醛、正戊醇、正己酸、1－辛烯－3－醇、6－甲基－5－庚烯－2－酮、辛醛、正辛醇、壬醛、壬醇、2－甲基丁酸乙酯、芳樟醇均為氣相色譜純，購(gòu)自于上海晶純?cè)噭┯邢薰?順式－2－戊烯－1－醇、反式－3－己烯－1－醇、順式－2－己烯－1－醇、反式－2－庚烯－1－醇、正庚醇、d－檸檬烯、反式－2－辛烯－1－醇、順式氧化芳樟醇、反式氧化芳樟醇、癸醛等標(biāo)準(zhǔn)品均為氣相色譜純，購(gòu)自于Sigma試劑公司．

1.3 3種柚汁的制備

將柚子去皮，利用高速組織搗碎機(jī)將果肉搗碎，置于4層紗布上過濾，收集濾液，即得新鮮柚汁，使用前5000 r/min離心5 min．

1.4 固相微萃取條件優(yōu)化

取1 mL柚汁于6 mL配有聚四氟乙烯瓶蓋的小瓶中，在一定溫度下先平衡10 min，再進(jìn)行一定時(shí)間的吸附．吸附結(jié)束后立即將吸附頭置于氣相色譜進(jìn)樣口中，在250℃下解吸附5 min．由于國(guó)內(nèi)外對(duì)果汁揮發(fā)性成分的固相微萃取的萃取頭材料一般都選擇DVB/CAR/PDMS材料，因此不對(duì)萃取頭材料進(jìn)行選擇，對(duì)吸附時(shí)間和吸附溫度進(jìn)行選擇．結(jié)合文獻(xiàn)中的萃取條件，吸附時(shí)間選擇10、20、30、40 min 4個(gè)水平，吸附溫度選擇30、40、50℃ 3個(gè)水平，以萃取的揮發(fā)性成分的總峰面積作為優(yōu)化指標(biāo)．

1.5 揮發(fā)性成分的GC－MS分析

色譜條件:Rtx－5MS毛細(xì)管色譜柱 (Rtx－5MS，60 m×0.32 mm，0.25 μm)，載氣為高純氦氣，流量3 mL/min，分流比10∶1;升溫程序:初始溫度35℃，保持0.3 min，接著以12℃/min升溫至240℃，保持2 min．

質(zhì)譜條件:離子源溫度250℃，質(zhì)譜接口溫度為280℃，電離方式為EI，檢測(cè)器電壓0.82 kV，SCAN模式，掃描范圍35～500 m/z．

1.6 揮發(fā)性成分的定性

柚汁揮發(fā)性成分采用了3種方式共同定性:1)GC－MS質(zhì)譜圖;2)樣品峰的保留指數(shù)，參考Kratz和Van den Dool[11]于1963年定義的程序升溫保留指數(shù);3)與標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行對(duì)照．

1.7 揮發(fā)性成分的定量及香氣值的計(jì)算

柚汁揮發(fā)性成分的定量是通過將揮發(fā)性成分的標(biāo)準(zhǔn)品配制成6個(gè)不同濃度梯度的混標(biāo)，每個(gè)濃度的混標(biāo)中均添加1 μg/L的環(huán)己酮作為內(nèi)標(biāo)，繪制各揮發(fā)性成分峰面積相對(duì)于1 μg/L內(nèi)標(biāo)峰面積比例的標(biāo)準(zhǔn)曲線，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行揮發(fā)性成分含量的計(jì)算．香氣值的計(jì)算方法為揮發(fā)性成分的濃度值除以揮發(fā)性成分在水中的閾值．

2 結(jié)果與討論

2.1 萃取時(shí)間和萃取溫度優(yōu)化

固相微萃取的時(shí)間優(yōu)化結(jié)果如圖1所示，隨著萃取時(shí)間的增加，萃取的揮發(fā)性成分的總峰面積逐漸增加，但當(dāng)萃取時(shí)間為30 min和40 min時(shí)，揮發(fā)性成分總峰面積不存在顯著性差異，因此，選擇萃取30 min作為最佳的萃取時(shí)間．

固相微萃取溫度選擇結(jié)果如圖2所示，隨著萃取溫度的升高，萃取的揮發(fā)性成分總峰面積逐漸增加，但當(dāng)萃取溫度為40℃和50℃時(shí)，萃取的揮發(fā)性成分總峰面積不存在顯著性差異，因此，選擇40℃作為最佳溫度進(jìn)行萃取．

圖1 萃取時(shí)間對(duì)揮發(fā)性成分總峰面積的影響Fig.1 Effect of extract time on the total peak area of volatiles

2.2 3種柚汁中的主要揮發(fā)性成分

圖2 萃取溫度對(duì)揮發(fā)性成分總峰面積的影響Fig.2 Effect of extract temperature on the total peak area of volatiles

表1為3種柚汁中揮發(fā)性成分的定性定量結(jié)果，由表1可以看出，根據(jù)質(zhì)譜圖相似度檢索、保留指數(shù)與文獻(xiàn)中保留指數(shù)比較、保留時(shí)間與標(biāo)準(zhǔn)品保留時(shí)間比較等方法，在3種柚汁中共鑒定出25種揮發(fā)性成分，包括11種醇類、7種醛類、2種萜烯類、2種萜烯氧化物、2種酯類、1種酮類．其中琯溪蜜柚汁、平和紅柚汁、度尾文旦柚汁中鑒定出的揮發(fā)性成分分別為23種、17種、16種，3種柚汁共有的揮發(fā)性成分有13種，分別為正戊醇、正己醛、反式－2－己烯醛、反式－3－己烯－1－醇、庚醛、6－甲基－5－庚烯－2－酮、辛醛、d－檸檬烯、正辛醇、順式氧化芳樟醇、反式氧化芳樟醇、壬醛、癸醛，一些成分只在一種或兩種柚汁中被檢出，說明不同品種的柚汁所含有的揮發(fā)性成分種類存在很大差異．3種柚汁總揮發(fā)性成分的質(zhì)量濃度分別為1452.59、484.93、94.89 μg/L，這說明3種柚汁的香氣強(qiáng)度可能會(huì)相差很大．其中，琯溪蜜柚汁中質(zhì)量濃度較高的成分為反式－3－己烯－1－醇 (765.26 μg/L)和正己醇 (323.89 μg/L);平和紅柚汁中質(zhì)量濃度較高的是正己醛 (175.21 μg/L)、d－檸檬烯 (98.59 μg/L)和順式－3－己烯醛(90.62 μg/L)，度尾文旦柚汁中質(zhì)量濃度較高的成分為 d－檸檬烯 (21.99 μg/L)和正戊醇(15.40 μg/L)．表2提供了3種柚汁各揮發(fā)性成分定量標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢測(cè)范圍、相關(guān)系數(shù)，其中標(biāo)準(zhǔn)曲線是通過各揮發(fā)性成分峰面積相對(duì)于1 μg/L內(nèi)標(biāo)的峰面積的比例繪制的．

為了更清楚地了解各揮發(fā)性成分對(duì)柚汁香氣的貢獻(xiàn)，本文計(jì)算了各揮發(fā)性成分的香氣值，香氣值大小可以用來評(píng)價(jià)各揮發(fā)性成分對(duì)柚汁香氣的貢獻(xiàn)大小[12]，各揮發(fā)性成分的香氣值列于表3中．結(jié)果顯示，琯溪蜜柚汁、平和紅柚汁、度尾文旦柚汁的總香氣值分別為35.92、60.28、7.80，由此可以看出，平和紅柚汁的香氣強(qiáng)度最大，其次為琯溪蜜柚汁，度尾文旦柚汁的香氣強(qiáng)度較其他兩種柚汁的香氣強(qiáng)度要小很多．

2.3 醇類揮發(fā)性成分的比較與分析

3種柚汁中的醇類揮發(fā)性成分種類最多，琯溪蜜柚汁中的反式－3－己烯－1－醇 (765.26 μg/L)和正己醇 (323.89 μg/L)兩種醇類的含量占總揮發(fā)性成分的75%，但這兩種揮發(fā)性成分在水中的香氣閾值均較高，分別為1000 μg/L和1620 μg/L，這兩種揮發(fā)性成分的香氣值分別為0.77和0.20(見表3)，對(duì)琯溪蜜柚汁香氣貢獻(xiàn)很小，而在平和紅柚汁和度尾文旦柚汁中，這兩種醇類的含量均不大或未檢出．在琯溪蜜柚汁中，1－辛烯－3－醇的香氣值最大 (13.40)，因?yàn)槠湓谒械南銡忾撝岛艿?(1 μg/L)，1－辛烯－3－醇具有蘑菇的氣味[13]，在平和紅柚汁和度尾文旦柚汁中均未檢出該成分．芳樟醇是許多柑橘類水果的重要香氣成分，因?yàn)槠渚哂休^低的香氣閾值與令人愉悅的花香氣味[14]，但在琯溪蜜柚汁和平和紅柚汁中檢出的含量均很低，在度尾文旦柚汁中未檢出，因此其對(duì)這3種柚汁的香氣貢獻(xiàn)均不大．

2.4 醛類揮發(fā)性成分的比較與分析

醛類是柑橘類水果重要的香氣成分，在琯溪蜜柚汁、平和紅柚汁、度尾文旦柚汁中，分別檢出了6種、7種、7種醛類揮發(fā)性成分，正己醛是一種具有青草氣味的揮發(fā)性成分[12]，其在平和紅柚汁中的含量最大，由表3可以看出，正己醛在平和紅柚汁中的香氣值為38.94，占總香氣值的65%，在琯溪蜜柚汁中其香氣值為10.42，占總香氣值的29%．因此，正己醛是平和紅柚汁和琯溪蜜柚汁的特征香氣成分．另一具有青草氣味的揮發(fā)性成分順式－3－己烯醛[15]在平和紅柚汁和度尾文旦柚汁中被檢測(cè)出，其在平和紅柚汁中的香氣值為3.37，對(duì)平和紅柚汁香氣有一定的貢獻(xiàn)．此外，對(duì)平和紅柚汁香氣影響較大的醛類揮發(fā)性成分還包括辛醛、壬醛、癸醛等，這3種醛類揮發(fā)性成分分別具有檸檬氣味、蒸煮氣味、水果氣味等[16]，其中癸醛對(duì)度尾文旦柚汁的香氣貢獻(xiàn)較大．

表1 琯溪蜜柚汁、平和紅柚汁及度尾文旦柚汁揮發(fā)性成分含量Tab.1 Concentrations of volatiles of Guanxi pummelo juice，Pinghe red pummelo juice and Duwei pummelo juice

表2 柚汁揮發(fā)性成分定量標(biāo)準(zhǔn)曲線Tab.2 Standard curves of the volatile components of the pummelo juice

2.5 萜烯類及萜烯醇氧化物揮發(fā)性成分的比較與分析

在3種柚汁中，均檢測(cè)到萜烯類成分檸檬烯，其中平和紅柚汁中的含量最高 (98.59 μg/L)，但其香氣值較小，因此對(duì)柚汁香氣影響較小．月桂烯只在度尾文旦柚汁中檢出，且其含量較少．在3種柚汁中，均檢測(cè)到含有萜烯醇氧化物順式芳樟醇氧化物和反式芳樟醇氧化物，這兩種成分具有令人愉悅的香甜氣味[15]，但是由于其在柚汁中的含量較低，因此其香氣值很小，對(duì)柚汁的香氣貢獻(xiàn)很?。?/p>

2.6 酯類及酮類揮發(fā)性成分的比較與分析

酯類揮發(fā)性成分一般含量較低，但大多數(shù)具有令人愉悅的香氣，在琯溪蜜柚汁中檢測(cè)到較低含量的2－甲基丁酸乙酯，在其他兩種柚汁中未檢測(cè)到，2－甲基丁酸乙酯具有令人愉悅的香甜氣味[17]，其在琯溪蜜柚汁中的香氣值為5.87，占總香氣值的16%，因此，2－甲基丁酸乙酯對(duì)琯溪蜜柚汁的香氣具有較大的貢獻(xiàn)．在3種柚汁中均只檢測(cè)出一種酮類揮發(fā)性成分6－甲基－5－庚烯－2－酮，但成分含量均較小且其在水中的香氣閾值較大 (160 μg/L)，因此對(duì)柚汁的香氣影響較小．

2.7 3種柚汁香氣的比較

琯溪蜜柚汁香氣主要由1－辛烯－3－醇、正己醛、2－甲基丁酸乙酯等成分貢獻(xiàn)，主要表現(xiàn)為蘑菇氣味、青草氣味、香甜氣味等．平和紅柚汁香氣主要由正己醛、癸醛、順式－3－己烯醛、辛醛、芳樟醇等成分貢獻(xiàn)，因此平和紅柚汁主要具有青草氣味、水果氣味、柑橘氣味、香甜氣味等．而度尾文旦柚汁香氣組成與其他兩種柚汁香氣組成相差較大，其香氣主要由癸醛貢獻(xiàn)的水果氣味和正己醛貢獻(xiàn)的青草氣味組成．

表3 琯溪蜜柚汁、平和紅柚汁及度尾文旦柚汁揮發(fā)性成分香氣值Tab.3 Odor activity values of volatiles of Guanxi pummelo juice，Pinghe red pummelo juice and Duwei pummelo juice

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