蘭 蘭，陳 笑，于立榮，魏 健

(長春師范大學生命科學學院，吉林長春 130032)

人參快繁條件的優(yōu)化

蘭 蘭，陳 笑，于立榮，魏 健

(長春師范大學生命科學學院，吉林長春 130032)

以人參種子在無菌條件下培養(yǎng)出來的無菌苗的幼嫩葉片以及不同器官、人參成體的塊莖及葉作為外植體，接種到附加著不同濃度的NAA、KT、IAA、6-BA以及它們分別組合的MS固體培養(yǎng)基上；總結(jié)出外植體在同樣的誘導條件下有很大的差異，且不同的培養(yǎng)基對外植體的影響不同。結(jié)果表明，MS+NAA0.1mg·L-1+KT0.5mg·L-1是誘導愈傷組織的最好的培養(yǎng)基；最理想的誘導叢生芽的培養(yǎng)基為MS+6-BA1.5 mg·L-1+NAA0.5mg·L-1；最佳誘導不定芽生根的培養(yǎng)基為MS+KT0．5mg·L-1+IAA0．3mg·L-1+6-BA0．2mg·L-1+活性炭3g；移栽、扦插的試管苗在爐灰渣中生長得最旺盛，所以最理想的基質(zhì)是爐灰渣。

人參；培養(yǎng)基；快速繁殖；無菌苗；誘導

人參(PanaxginsenyC,A mey)是草本植物，多年生，隸屬于五加科。它可治勞傷虛損、反胃吐食、虛咳喘促、自汗暴脫、眩暈頭痛、消渴、小兒慢驚、久虛不復等一切氣血津液不足之癥，在滋補藥物、保健藥物、保健食品、化妝品中占有重要地位[1]。人參的主要作用是調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)，除此之外，還可以改善心臟功能、降血糖、抗腫瘤、抗衰老， 效果是多方面的[2-5]。由于人參的神秘性和奇特性，目前它的身價越來越高，市場越來越大，應用范圍也越來越廣。從傳統(tǒng)的強心強身藥物，到流行的保健品，再到時髦的化妝品，幾乎都加上人參的成分或名號，令人對人參產(chǎn)生了濃厚的興趣，越來越多的學者開始更深入而廣泛地研究人參[6-9]。野生人參對生長環(huán)境的要求非常嚴格，其生長的地段多在海拔300～800m以下的低山；喜歡陰涼氣候，春季氣溫達到15℃，土壤溫度在10℃左右，人參才能出芽；喜歡漫射光和散射光，散射光具有光譜中最為豐富的紫外光；對水分要求也比較嚴格，適宜空氣濕度為40%～80%，土壤濕度為40%～50%之間。對人參進行開發(fā)可以很好地解決人們的需求，提高其市場價值[10-15]。本實驗選用的材料是無菌苗及人參成體，并對人參成體進行了嚴格的消毒，利用組織培養(yǎng)的方法，對人參的無性快速繁殖技術(shù)進行了討論，研究了不同植物生長調(diào)節(jié)劑及其組合對人參愈傷組織的誘導和增殖效應，從而更有效地對人參進行開發(fā)研究。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗選取由吉林白山地區(qū)提供的人參種子培養(yǎng)獲得的無菌苗和成體人參作為實驗材料。

1.2 實驗方法

1.2.1 獲得外植體

1.2.1.1獲得無菌苗

選取一定數(shù)量的人參種子，放入250mL廣口瓶中用自來水浸泡數(shù)小時，再加入0.02%的餐洗凈水浸泡10～15min，用自來水沖洗干凈。加入75%的酒精浸泡4min，倒去酒精，以無菌水漂洗2～3次(重復一次)。

將種子轉(zhuǎn)到另一個滅過菌的100～150ml的三角瓶中，將約為20mL 0.1%的升汞液注入瓶中，經(jīng)過1min的滅菌浸泡，并連續(xù)使用無菌水沖洗，至少5～6次，才能夠?qū)⑸瘡氐壮ァ娜瞧恐腥〕鱿竞蟮姆N子，使用無菌濾紙去除種子上的水分，在MS+NAA1.0mg·L-1+6-BA2.0mg·L-1固體培養(yǎng)基上接種。培養(yǎng)溫度非常重要，應為(25±2)℃，每一個粒種子相距1.5cm左右，經(jīng)過大概20d的培養(yǎng)即可獲得無菌苗，以用作組織培養(yǎng)的外植體材料。

1.2.1.2 人參成體莖塊葉的消毒

先用水沖洗干凈泥土，再用加餐洗凈的自來水浸泡，用自來水沖洗，移至超凈工作臺上，用75%的酒精浸泡10～30s。以無菌水沖洗4次后，迅速倒入0.1%的HgCl2溶液中浸泡8～12min，傾去HgCl2溶液，再用無菌水沖洗4～5次。

1.2.2 接種

將已獲得的無菌苗移入超凈工作臺上，將無菌苗小心地從培養(yǎng)容器中取出，盡量不要損傷葉片。在無菌濾紙上切下葉片，再用解剖刀將葉片切成0.3～0.5cm2的小塊，接種于培養(yǎng)基上，并且要讓其背面接觸培養(yǎng)基，這樣有利于愈傷組織的產(chǎn)生。葉片切塊在培養(yǎng)容器中的放置密度以相互之間間隔1.5cm為宜。

將已消毒的人參置于超凈工作臺上，將根、葉柄切成可鑒定的0.3～0.5cm的小段，平放在培養(yǎng)基上；如果是葉片，同上切成可鑒定的0.3～0.5cm2的小塊，葉片平鋪于培養(yǎng)基上。

1.2.3 叢生芽的誘導

要選出最適合的培養(yǎng)基，具體方法：所選擇的無菌葉片一定要具備愈傷組織，切成小塊，基本培養(yǎng)基選擇MS，進行叢生芽誘導。叢生芽誘導培養(yǎng)基可以附加不同濃度的NAA，6-BA，觀察后得到結(jié)果。

1.2.4 誘導生根

在壯苗培養(yǎng)基或芽再生培養(yǎng)基上選取較為強壯的無根苗，取出后移至MS的基本培養(yǎng)基上，進行生根誘導，同時應附加不相同濃度的IAA的生根培養(yǎng)基。

1.2.5 移栽

打開已經(jīng)生根的試管瓶進行煉苗，煉苗的必備條件是溫度25℃，5000～10000LX的光照強度，時間為3～5d。當有小群的菌落剛剛出現(xiàn)在培養(yǎng)基的表面時，就及時地將試管苗從試管瓶中移出。

1.2.6 培養(yǎng)條件

基本培養(yǎng)基為MS，附加不同濃度的激素及其組合。培養(yǎng)基中必須全部都加入3.5%的蔗糖，1.2%的瓊脂，pH=5.7，光照條件為1500～3500LX，溫度設置為26±1℃，每天13～17h的光照時間。

2 結(jié)果與分析

2.1 對人參愈傷組織，不同的植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)有著不同的誘導效應

對MS培養(yǎng)基附加不同的激素，然后在其上接種經(jīng)過以上方法處理過的外植體。30d時，誘導現(xiàn)象在幾種不同的外植體上都有所表現(xiàn)。培養(yǎng)基含有的激素濃度不同，對誘導愈傷組織的誘導率及生長勢的影響也各異(表1)。

表1 不同濃度的激素的培養(yǎng)基對誘導愈傷組織的誘導率及生長勢影響

結(jié)果表明，誘導愈傷組織最適合的外植體為無菌苗的葉及人參成體的根。最佳的培養(yǎng)基為MS+NAA0.1mg·L-1+KT0．5mg·L-1，成活率達75%以上，長勢相對較好。

2.2 叢生芽的誘導

在MS基本培養(yǎng)基上培養(yǎng)切塊后的帶有愈傷組織的葉片，附加不同濃度的NAA，6-BA的芽誘導培養(yǎng)基，大概4～5w以后，不定芽便開始在愈傷組織上產(chǎn)生。統(tǒng)計數(shù)據(jù)說明，在MS+NAA0．5mg·L-1+6-BA1.5mg·L-1中生長得比較好。在壯苗培養(yǎng)基上培養(yǎng)從叢生芽中選取的比較強壯的芽。

2.3 誘導生根

無根苗經(jīng)過培養(yǎng)，大約在7d左右開始生根。實驗數(shù)據(jù)說明： MS+KT0.5mg·L-1+6-BA0.2mg·L-1+IAA0.3mg·L-1+活性炭3g是最適合的生根培養(yǎng)基。

2.4 移栽

打開已經(jīng)生根的試管瓶進行煉苗，煉苗的必備條件是溫度為25℃、5000～10000LX的光照強度，時間為4～6d。當有小的菌落剛剛出現(xiàn)在培養(yǎng)基的表面時，就及時地將試管苗從試管瓶中移出。為了保證一定的成活率，萬一沒有出現(xiàn)菌落則要適當延長煉苗時間。

移栽的時候一定要細致地從瓶中取出苗，盡可能不要損害苗。苗取出后放入事先備好的干凈清水中，用試管刷或毛刷輕輕地掃除根部，盡可能徹底完全地清除掉苗根部周圍的瓊脂，移至河沙、珍珠巖、肥沃土壤、爐灰渣4種基質(zhì)中。置于26℃的溫度條件下，濕度90%左右的散射光條件下，10d后觀察后得出：移栽的最佳基質(zhì)是爐灰渣，這是由于爐灰渣是經(jīng)過高溫灼燒形成的。其中通氣性好、菌少，而且吸熱性好的黑色基質(zhì)使爐灰渣的溫度高，試管苗成活率高。

3 討論

在移栽時，特別要洗掉瓊脂，因為瓊脂發(fā)霉容易引起爛根，這樣會浪費資源，還會耽誤實驗的進程，因此在去除瓊脂時一定要精細、認真。

人參的培養(yǎng)條件非常嚴格，所以必須每一步都遵循它的生長條件，并且確保組培環(huán)境無菌。如果無菌工作做得不好，培養(yǎng)的幼苗就會生長緩慢甚至培育失敗。所以這次實驗在組培過程中嚴格遵守實驗室的要求，達到真正的無菌條件，讓實驗更加真實，數(shù)據(jù)更加可信。

4 結(jié)論

本實驗對所選的培養(yǎng)基附加了各種不同的激素濃度，實驗材料所選用的外植體為人參無菌苗的幼葉。經(jīng)過培養(yǎng)，得到的實驗數(shù)據(jù)表明：MS+KT0.5mg·L-1+IAA0.3mg·L-1+6-BA0.2mg·L-1+活性炭3 g是誘導不定芽生根的最好的培養(yǎng)基；MS+6-BA1.5mg·L-1+NAA0.5mg·L-1是叢生芽誘導的最佳培養(yǎng)基；MS+NAA0.1mg·L-1+KT0.5mg·L-1則是誘導愈傷組織的最理想的培養(yǎng)基。

[1]李斌超,嚴井靜.土人參的栽培技術(shù)及開發(fā)利用[J].中國林副特產(chǎn),1997(3):31-32.

[2]潘瑞熾.植物組織培養(yǎng)[M].廣州:高等教育出版社,2003(8):60-80.

[3]曹孜義.現(xiàn)代植物組織培養(yǎng)技術(shù)[M].蘭州:科學技術(shù)出版社,2003(12):50-55.

[4]周麗華,呂華飛,吳鍵字,等.莖尖分生組織培養(yǎng)獲得無病毒康乃馨植株的研究[J].云南農(nóng)業(yè)大學學報,1994(4):32-35.

[5]馬艷麗.越橘組培快繁技術(shù)研究[J].林業(yè)科技,2005(1):3-5.

[6]李洪雯,陳克玲，宋興榮，等.黑琥珀李半木質(zhì)化嫩梢離體快繁研究[J].西南園藝,2005(1):17-18.

[7]李品漢.土人參[J].致富之友,2005(9):23.

[8]倪宏正,曹堅.早春大棚馬鈴薯脫毒種薯快繁技術(shù)[J].長江蔬菜,2008(3):37-38.

[9]劉慶昌,吳國良.植物細胞組織培養(yǎng)[M].北京:中國農(nóng)業(yè)大學出版社,2003:20-30.

[10]鄭加協(xié),李華東.蜜寶菠蘿組織培養(yǎng)及低成本快繁技術(shù)研究[J].果樹學報,2011(1):27-30.

[11]王蓮英,朱秀珍,虞佩珍,等.中國名貴花卉鑒賞與栽培[M].合肥:安徽科學技術(shù)出版社,1997:15-23.

[12]鐘士傳.有機物和激素對四倍體刺槐微體快繁的影響[J].林業(yè)科技,2009(1):1-2.

[13]崔德才,徐培文.植物組織培養(yǎng)與工廠化育苗[M].北京:化學工業(yè)出版社,2008:30-40.

[14]吳殿星,楊繁榮.植物組織培養(yǎng)[M].上海:交通大學出版社,2004:9-35.

[15]Anderson W C,Carstens J B.Tissue culture propagation lf broccoli.Brassica loeraceo(Italica,group),for use in Flhybrid seed production[J].J Amer Soc Hort Sci,1977,102(1):69-73.

2014-09-27

蘭 蘭(1981- )，女，吉林長春人，長春師范大學生命科學學院碩士研究生，長春師范大學基建處助理工程師，從事細胞遺傳學研究。

魏 健(1980- )，男，吉林長春人，講師，博士，從事植物學研究。

S567.5+1

A

2095-7602(2014)06-0078-04