王嵐，夏夢(mèng)雷，陳洪章

中國(guó)科學(xué)院過程工程研究所 生物質(zhì)煉制工程北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100190

煉制技術(shù)

過程工程在木質(zhì)纖維素發(fā)酵抑制物解除中的應(yīng)用

王嵐，夏夢(mèng)雷，陳洪章

中國(guó)科學(xué)院過程工程研究所 生物質(zhì)煉制工程北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100190

發(fā)酵抑制物對(duì)宿主細(xì)胞產(chǎn)生毒害作用，是木質(zhì)纖維素生物煉制的主要瓶頸之一。減少抑制物含量、解除抑制作用是提高發(fā)酵效率的重要環(huán)節(jié)。本文討論了木質(zhì)纖維素發(fā)酵抑制物的來源、組成、特點(diǎn)以及相應(yīng)的解除方法，提出了“源頭降低抑制物—纖維素木質(zhì)素分級(jí)轉(zhuǎn)化”煉制模式和“發(fā)酵促進(jìn)劑設(shè)計(jì)技術(shù)”，為木質(zhì)纖維素發(fā)酵抑制物的解除及木質(zhì)纖維素開發(fā)利用提供了全新的技術(shù)路線。

木質(zhì)纖維素，發(fā)酵抑制物，源頭解除抑制物，分級(jí)轉(zhuǎn)化，發(fā)酵促進(jìn)劑

木質(zhì)纖維素是地球上最為豐富的可再生資源。全球每年由光合作用而產(chǎn)生的木質(zhì)纖維素總量約為1 000億t，內(nèi)含的能量相當(dāng)于600億至800億t石油，即全世界每年石油總產(chǎn)量的20?27倍。但目前木質(zhì)纖維素的利用率不到3%。我國(guó)木質(zhì)纖維素的年產(chǎn)量就超過10億t[1]，但僅有少部分被用于飼料、造紙等行業(yè)，并且普遍存在著原料利用率低、環(huán)境污染嚴(yán)重等問題。此外，每年約2億t木質(zhì)纖維素被就地焚燒，造成了巨大的資源浪費(fèi)和嚴(yán)重的環(huán)境污染[2]。

隨著石油危機(jī)和環(huán)境問題的日益突出，開發(fā)秸稈等木質(zhì)纖維素原料生產(chǎn)能源化工產(chǎn)品對(duì)于促進(jìn)我國(guó)可持續(xù)發(fā)展、減少溫室效應(yīng)具有非常重大的意義。由于木質(zhì)纖維素結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性，預(yù)處理過程中會(huì)產(chǎn)生大量的抑制物，嚴(yán)重制約著木質(zhì)纖維素的生物質(zhì)轉(zhuǎn)化。因此，實(shí)現(xiàn)秸稈基產(chǎn)品的工業(yè)化生產(chǎn)，必須首先建立適當(dāng)?shù)脑项A(yù)處理、發(fā)酵液脫毒等技術(shù)體系?；诖?，本文對(duì)發(fā)酵液脫毒技術(shù)進(jìn)行了綜述，并重點(diǎn)介紹了本實(shí)驗(yàn)室所提出的“源頭降低抑制物—纖維素木質(zhì)素分級(jí)轉(zhuǎn)化”煉制模式和“發(fā)酵促進(jìn)劑設(shè)計(jì)技術(shù)”，期待對(duì)新型脫毒工藝的開發(fā)與應(yīng)用有一定的啟發(fā)，助力于木質(zhì)纖維素生物質(zhì)轉(zhuǎn)化產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

1 木質(zhì)纖維素發(fā)酵抑制物的來源和抑菌機(jī)制

秸稈等木質(zhì)纖維素原料的主要組分是纖維素、半纖維素和木質(zhì)素[3]。在采用稀酸、濕式氧化和蒸汽爆破等方法對(duì)纖維原料進(jìn)行預(yù)處理的過程中，上述物質(zhì)會(huì)發(fā)生一系列復(fù)雜的理化反應(yīng)，產(chǎn)生大量結(jié)構(gòu)復(fù)雜的抑制物[4]，如圖1所示。

纖維素在酸水解過程中產(chǎn)生葡萄糖，并且在高溫酸性條件下，葡萄糖可以繼續(xù)降解生成5-羥甲基糠醛 (5-hydroxymethylfurfural，HMF)、甲酸和乙酰丙酸等物質(zhì)。半纖維素在汽爆或酸性預(yù)處理?xiàng)l件下發(fā)生水解反應(yīng)，產(chǎn)生木糖、阿拉伯糖、半乳糖等多種單糖組分，這些單糖組分在高溫酸性條件下會(huì)進(jìn)一步降解生成糠醛、HMF和甲酸等產(chǎn)物。此外，半纖維素上的乙?；鶊F(tuán)會(huì)被水解，產(chǎn)生乙酸。木質(zhì)素在預(yù)處理過程中也會(huì)發(fā)生少量降解，其降解的主要產(chǎn)物是多種單環(huán)芳香族類化合物。

Palmqvist等[6]將抑制物分為三大類：弱酸類、呋喃衍生物和酚類化合物。目前，有關(guān)這些物質(zhì)的抑菌機(jī)制主要是以釀酒酵母為模式微生物進(jìn)行研究而得到的。甲酸、乙酸和乙酰丙酸等弱酸性物質(zhì)的抑制作用主要是通過破壞存在于細(xì)胞膜上H+濃度梯度實(shí)現(xiàn)的[7]。呋喃類衍生物主要是糠醛和5-羥甲基糠醛。醛類物質(zhì)對(duì)酵母的抑制作用表現(xiàn)在降低酒精體積產(chǎn)率和生產(chǎn)率、抑制酵母生長(zhǎng)。酚類化合物來源于木質(zhì)素的降解，其中阿魏酸、3-甲基-4-羥基苯甲酸、4-羥苯乙酮、香草酸等是典型的酚類化合物，并且小分子量的酚類化合物的抑菌作用最強(qiáng)[6]，其毒性大于糠醛[8]。另外，苯酚單體上基團(tuán)的取代位置也影響化合物的毒性，甲氧基團(tuán)的數(shù)目也與菌種生長(zhǎng)的抑制作用有關(guān)。酚類物質(zhì)的抑制作用一般認(rèn)為是其滲透到細(xì)胞膜內(nèi)，破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的完整性，從而影響發(fā)酵微生物的正常生長(zhǎng)，降低發(fā)酵效率。

圖1 木質(zhì)纖維素主要組分及其降解物[5]Fig. 1 Main components of lignocellulose and the corresponding degradation products[5].

2 發(fā)酵抑制物解除策

抑制物解除的基本策略按照處理對(duì)象的不同，可以分為3種：木質(zhì)纖維素物料脫毒、抑制物耐受菌篩選和過程控制優(yōu)化。

2.1 木質(zhì)纖維素物料脫毒

木質(zhì)纖維素物料脫毒是指針對(duì)酸解、堿解、汽爆等預(yù)處理后的物料，通過一定手段，去除抑制物的過程。目前木質(zhì)纖維素物料脫毒策略大體上可以分為物理法、化學(xué)法和生物法預(yù)處理3大類。物理法是直接去除水解液中的有毒物質(zhì)，而化學(xué)法和生物法在于將有毒物質(zhì)轉(zhuǎn)化為無毒物質(zhì)。

目前，文獻(xiàn)已報(bào)道的物理法包括水洗法、蒸發(fā)法、吸附法、萃取法、離子交換法、電滲析法等。水洗法常用于去除汽爆預(yù)處理產(chǎn)生的可溶性發(fā)酵抑制物[9]。蒸發(fā)法是一種簡(jiǎn)單地去除預(yù)處理水解液中乙酸和糠醛等揮發(fā)性抑制物的方法[10]。萃取法則是利用糖類與抑制物在萃取劑中溶解性的不同，用溶劑將抑制物從發(fā)酵溶液中分離出來，如采用乙酸乙酯萃取可以去除木質(zhì)纖維素水解液中56%的乙酸和所有的糠醛、香草醛和4-羥苯甲酸[11]。吸附法主要利用樹脂和活性炭具有的較強(qiáng)的吸附能力，去除水解液中的抑制物。一般地，脫毒的效果依次為陰離子交換樹脂＞中性樹脂＞陽離子交換樹脂[12]。在堿性條件下，陰離子交換樹脂能有效地去除陰離子和中性抑制物。活性炭對(duì)抑制物的去除效果受抑制物性質(zhì)、水解液pH、處理溫度和時(shí)間以及活性炭濃度的影響[13]。電滲析是將陰陽離子交換膜交替排列于正負(fù)電極之間，用特質(zhì)的隔板將其隔開，組成淡化和濃縮兩個(gè)系統(tǒng)，在直流電源的作用下，以電位差為推動(dòng)力，利用膜材料的選擇透過性，把電解質(zhì)從溶液中分離出來，從而實(shí)現(xiàn)溶質(zhì)的分離、濃縮、精制和提純。雙極性膜是一種新型的離子交換復(fù)合膜。它由陽離子交換層 (N型膜) 和陰離子交換層 (P型膜) 復(fù)合而成，在直流電場(chǎng)的作用下將水離解，在膜兩層分別得到氫離子和氫氧根離子。雙極性膜電滲技術(shù)目前已經(jīng)應(yīng)用于酸的生產(chǎn)和回收工藝[14-15]。

化學(xué)法主要是通過加入化學(xué)試劑使水解液中的抑制物形成沉淀或者通過調(diào)節(jié)pH使抑制物解離以去除毒性化合物的方法。目前應(yīng)用最廣泛的是1945年Leonard和Hajny[16]報(bào)道的過量堿法 (Over liming)，即先向預(yù)水解液中加入Ca(OH)2，調(diào)節(jié)pH到9?12，使抑制物沉淀，經(jīng)過離心后再向得到的上清水解液中加入稀硫酸，調(diào)節(jié)pH到5.5。

生物法是指利用酶或者微生物的降解作用以達(dá)到改變抑制物結(jié)構(gòu)、降低毒性的方法[17]。生物法可分為酶處理和微生物處理。由于酶具有專一性，所以酶處理只能去除特定的抑制物。漆酶對(duì)酚類化合物的去除作用是明顯的，但對(duì)于乙酸、糠醛和羥甲基糠醛無去除作用[18]?；疑w鬼傘擔(dān)子菌Coprinus cinereus IFO 8371生產(chǎn)的過氧化物酶在H2O2存在的情況下，可以將香豆酸、阿魏酸、4-羥基苯甲酸、香草醛、紫丁香醛、香草酸6種化合物轉(zhuǎn)化成高分子量化合物，從而提高拜氏梭菌Clostridium beijerinckii利用木質(zhì)纖維素水解液發(fā)酵丁醇的性能[19]。微生物脫毒指的是利用絲狀軟腐菌Trichoderma reesei等微生物，去除水解液中乙酸、糠醛和安息香酸衍生物等的方法。例如，利用絲狀軟腐菌處理蒸汽爆破預(yù)處理過的柳樹半纖維素水解液，乙醇的產(chǎn)率可以提升3?4倍[20]。不同抑制物去除方法的優(yōu)缺點(diǎn)對(duì)比見表1。

表1 不同抑制物去除方法優(yōu)缺點(diǎn)對(duì)比Table 1 Comparison of the different inhibitors removal methods

2.2 抑制物耐受菌選育

物理、化學(xué)或生物等脫毒方法只能部分去除纖維素水解液中的抑制物，無法完全克服抑制物對(duì)宿主細(xì)胞的毒害作用，并且生物脫毒的費(fèi)用一般占到總投入的30%?40%，幾乎是木質(zhì)纖維素生物轉(zhuǎn)化過程中投入最大的一項(xiàng)工序，使得諸如丁醇等發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)一步降低了自己在同類產(chǎn)品中的競(jìng)爭(zhēng)力[21]。因此，從發(fā)酵微生物本身出發(fā)選育高耐受的菌株，則成為解決底物抑制物問題的另一種有效方法。根據(jù)育種方式的不同，可以分為傳統(tǒng)誘變、代謝工程和合成生物學(xué)。

傳統(tǒng)誘變是指通過一些強(qiáng)烈的化學(xué)誘變因子，如甲基磺酸乙酯 (EMS)、亞硝基胍 (NTC)、丙烯醇等，以及紫外線等物理誘變條件對(duì)出發(fā)菌進(jìn)行誘變以獲取抑制物耐受菌株的方法。由于單一的誘變方法具有菌種性狀不穩(wěn)定、突變方向隨機(jī)等缺點(diǎn)，最近幾年的研究多集中于復(fù)合誘變和菌種馴化。復(fù)合誘變是指利用多種誘變劑同時(shí)或者依次對(duì)出發(fā)菌進(jìn)行處理。誘變劑的復(fù)合處理有一定的協(xié)同誘變效應(yīng)，能增強(qiáng)誘變效果，并能將多種優(yōu)良性狀集中于同一菌株[22]。馴化是指讓細(xì)胞長(zhǎng)期在某一環(huán)境下生長(zhǎng)，使其能夠適應(yīng)并具有良好性狀的進(jìn)化過程。馴化是在對(duì)機(jī)理知識(shí)理解不足的情況下獲得具有目標(biāo)特性菌株的有效方法。丁明珠等以釀酒酵母為出發(fā)菌種，通過紫外誘變結(jié)合馴化的方法篩選出1株對(duì)于糠醛、苯酚和乙酸都有很強(qiáng)耐受能力的菌株[23]。Keating等[24]利用糠醛、5-羥甲基糠醛和乙酸溶液對(duì)釀酒酵母進(jìn)行馴化，得到了一株在纖維素水解液中具有良好發(fā)酵效果的酵母菌株。Liu等[25]也利用馴化的方法得到了能耐受糠醛的酵母菌株，從而實(shí)現(xiàn)了對(duì)纖維素水解液中糠醛抑制物的原位脫毒。

分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，使得產(chǎn)溶劑梭菌代謝工程改造成為了可能，外源基因和調(diào)控因子的引入，使代謝工程有別與傳統(tǒng)意義上的菌種改造。利用重組技術(shù)調(diào)控細(xì)胞中酶反應(yīng)、優(yōu)化代謝物的轉(zhuǎn)化與轉(zhuǎn)運(yùn)，可以有效增強(qiáng)宿主細(xì)胞對(duì)于抑制物的耐受能力。楊雪雪[26]對(duì)釀酒酵母同源二倍體單基因缺失株文庫(kù)進(jìn)行篩選，經(jīng)過初篩、復(fù)篩、驗(yàn)證等步驟，得到了163個(gè)糠醛抗性相關(guān)基因，并成功構(gòu)造出雙倍體單基因缺失株siz1/siz1，dep1/dep1，sap30/sap30和單倍體單基因缺失株siz1，dep1，sap30菌株，其對(duì)10 mmol/L糠醛的抗性比各自相應(yīng)的野生型菌株要高出100倍。Li等[27]利用酵母全基因組表達(dá)譜芯片，研究了釀酒酵母在轉(zhuǎn)錄組水平上對(duì)糠醛和醋酸的代謝響應(yīng)，發(fā)現(xiàn)增強(qiáng)HMG1基因可以提高胞內(nèi)糠醛的轉(zhuǎn)化效率，從而增強(qiáng)菌體的耐受能力。Gorsich等[28]通過對(duì)釀酒酵母單基因突變體庫(kù)的篩選找到62種與糠醛耐受性相關(guān)的基因。過表達(dá)其中的葡萄糖-6-磷酸脫氫酶基因ZWF1后，釀酒酵母可以在高濃度的糠醛下生長(zhǎng)，這可能是因?yàn)檫^表達(dá)ZWF1使得葡萄糖-6-磷酸脫氫酶的活性增加，為糠醛還原酶或依賴NADPH的脅迫應(yīng)激酶類提供了更多的還原動(dòng)力 (NADPH)，進(jìn)而提高了菌體耐受性。

目前為止，所得到的各種抑制物耐受菌大多是通過馴化或者傳統(tǒng)誘變篩選得到的。由于抑制物對(duì)于宿主細(xì)胞的抑制機(jī)理還不明確，很難通過定向設(shè)計(jì)獲得具有高耐受性的菌種。因此，深入了解水解液中抑制物與細(xì)胞的相互作用關(guān)系，揭示細(xì)胞的脫毒機(jī)制，進(jìn)而定向改造菌株，是當(dāng)前代謝工程亟待解決的問題。

3 新型抑制物解除工藝

傳統(tǒng)預(yù)處理方法[29-31]、菌種改造[24]等方法，對(duì)于突破木質(zhì)纖維素抑制物瓶頸、實(shí)現(xiàn)木質(zhì)素產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)是必不可少的[32]。但它們只專注于單一的技術(shù)突破，忽略了木質(zhì)纖維素本身所具有的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)[33]。實(shí)際上，木質(zhì)纖維素獨(dú)特的組成特點(diǎn)，可以為我們提供新的研究思路[34]；基于此，陳洪章課題組提出了“源頭降低抑制物——纖維素木質(zhì)素分級(jí)轉(zhuǎn)化”煉制模式，為木質(zhì)纖維素的開發(fā)和利用，探索出了一條全新的工藝路線；并在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步提出了“原位脫毒——發(fā)酵促進(jìn)劑設(shè)計(jì)技術(shù)”，它們共同組成了當(dāng)前最新型的抑制物解除工藝。

3.1 源頭降低木質(zhì)纖維素抑制物的分級(jí)轉(zhuǎn)化煉制工藝

木質(zhì)纖維素原料具有結(jié)構(gòu)復(fù)雜、不均一的多級(jí)結(jié)構(gòu)。從細(xì)胞組成上，可以分為纖維狀的纖維細(xì)胞和雜細(xì)胞 (包括導(dǎo)管、薄壁細(xì)胞、表皮細(xì)胞等)。纖維細(xì)胞木質(zhì)素含量較高，具有較發(fā)達(dá)的次生壁，因此厚度較大。薄壁細(xì)胞腔大、壁薄、長(zhǎng)度短，其成分主要為纖維素[35]。由于結(jié)構(gòu)和形態(tài)上的差異，這兩類細(xì)胞所要求的預(yù)處理?xiàng)l件也是不同的[21]。纖維細(xì)胞，細(xì)胞壁木質(zhì)化程度高，結(jié)構(gòu)致密，受熱過程中傳質(zhì)熱阻力大，且不易被撕裂；薄壁細(xì)胞，壁薄而腔大，即有利于傳質(zhì)傳熱，有利于水蒸氣閃蒸對(duì)其物理撕裂。因此，針對(duì)不同組織細(xì)胞分別優(yōu)化處理?xiàng)l件，開發(fā)出了二段汽爆分梳技術(shù)。

其具體的工藝過程如下：

1) 將汽爆壓力控制在0.5?1.0 MPa、維壓1?10 min，對(duì)秸稈原料進(jìn)行第一段蒸汽爆破處理。

2) 通過氣流分級(jí)裝置，將第一段汽爆物料進(jìn)行分級(jí)，得到薄壁組織和纖維組織。薄壁組織可以直接用于纖維素發(fā)酵。

3) 將分梳得到的纖維組織在壓力為1?1.5 MPa、維壓時(shí)間為1?10 min條件下進(jìn)行二段蒸汽爆破處理。

二段汽爆分梳工藝，不同于傳統(tǒng)所指的二段汽爆工藝，前者采用較溫和的汽爆條件進(jìn)行第一段汽爆，通過氣流分梳裝置將第一段物料(薄壁細(xì)胞) 分級(jí)，得到薄壁組織和纖維組織，再將纖維組織在適當(dāng)?shù)臈l件下進(jìn)行第二段汽爆。該工藝可以實(shí)現(xiàn)纖維素組分的有效分離，即能保證纖維組織達(dá)到較好的預(yù)處理效果，提高纖維原料的酶解效果，又能避免薄壁細(xì)胞的過度降解，從源頭控制了抑制物的產(chǎn)生，減少了脫毒單元操作的引入，簡(jiǎn)化了工藝。

在二段汽爆以后，將汽爆后的秸稈渣送入1.2 m3酸水解罐中，同時(shí)加入0.3%?0.5%的稀硫酸，物料和稀硫酸的體積比控制在1∶5?1∶7，在110?120 ℃的溫度下水解0.5?1.0 h，然后利用螺旋擠壓機(jī)將水解液中的液體和固體分開，分別得到水解液和水解渣。水解液主要成分為非半纖維素，水解渣中主要為木質(zhì)素和纖維素。繼而采用2%的堿液提取殘?jiān)械哪举|(zhì)素，提取率可達(dá)96%，隨后利用逐級(jí)酸性沉淀 (pH 5?2)分級(jí)木質(zhì)素的方法，可以制得小于6 kDa，6?10 kDa，10?20 kDa和大于20 kDa等不同分子量范圍的木質(zhì)素，用于不同功能原料的開發(fā)。

本課題組的研究發(fā)現(xiàn)，汽爆秸稈酶解液中并不存在糠醛、5-羥甲基糠醛與乙酸的抑制問題，而汽爆秸稈木質(zhì)素降解物才是抑制丁醇發(fā)酵的主要原因[36]。由于從源頭去除了木質(zhì)素對(duì)于半纖維素和纖維素發(fā)酵的干擾，發(fā)酵液中的抑制物種類較少，濃度較低，經(jīng)過簡(jiǎn)單脫毒(5%?10%的活性炭吸附室溫下處理8?12 h)，即可用于正常的丁醇發(fā)酵。

基于以上重大技術(shù)突破，組建出與其技術(shù)相配套的自主加工的工業(yè)化裝置系統(tǒng)，完成了年產(chǎn)600 t秸稈丁醇中試實(shí)驗(yàn)。所建立的技術(shù)工藝在中國(guó)吉林省松原市成功用于“30萬t/年秸稈煉制”產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。該生產(chǎn)線將為秸稈作為工業(yè)原料生產(chǎn)能源、材料和化學(xué)品提供新的思路和產(chǎn)業(yè)化示范。

該工藝有以下幾個(gè)特點(diǎn)：1) 可以從源頭降低抑制物的產(chǎn)生，簡(jiǎn)化了操作工序，降低了預(yù)處理的成本。2) 通過組分分離，保證了發(fā)酵底物的純度，提高了溶質(zhì)的傳質(zhì)速率和酶的接觸面積，提高了發(fā)酵效率。3) 實(shí)現(xiàn)了秸稈全組分高價(jià)化經(jīng)濟(jì)全利用，通過經(jīng)濟(jì)分?jǐn)偅黾恿四举|(zhì)纖維素的經(jīng)濟(jì)競(jìng)爭(zhēng)力。

本實(shí)驗(yàn)室所提出的“源頭降低抑制物——纖維素木質(zhì)素分級(jí)轉(zhuǎn)化”煉制模式，為木質(zhì)纖維素發(fā)酵抑制物的解除及木質(zhì)纖維素開發(fā)利用提供了全新的技術(shù)路線。

3.2 基于木質(zhì)纖維素發(fā)酵特點(diǎn)的過程強(qiáng)化工藝

從發(fā)酵微生物本身出發(fā)，通過增加發(fā)酵液中特殊的物質(zhì)，來提高微生物細(xì)胞對(duì)抑制物的耐受能力；或者選育出能夠耐受木質(zhì)纖維素水解液中各種抑制物，并具有較高發(fā)酵性能的微生物，以達(dá)到脫毒的目的，這種方法通常被稱為抑制物的原位脫毒。在木質(zhì)纖維素發(fā)酵過程中，往往微量級(jí)別 (mg/L) 的“特殊物質(zhì)”，就可以實(shí)現(xiàn)目標(biāo)產(chǎn)物發(fā)酵效率的成倍增長(zhǎng)，具有巨大的開發(fā)價(jià)值。

這些“特殊物質(zhì)”稱為發(fā)酵促進(jìn)劑，大多數(shù)屬于電子穿梭化合物，即具有多種氧化態(tài)和還原態(tài)的物質(zhì)。它們?cè)诩?xì)菌代謝過程中扮演著重要的角色。外源添加這種電子穿梭化合物，可以改變胞內(nèi)的電子流向，提高電子傳遞速率，進(jìn)而理性調(diào)控生物胞內(nèi)的能量狀態(tài)和生理狀態(tài)，提高菌體的耐受性和目標(biāo)產(chǎn)物的合成能力。常見的電子穿梭化合物，包括中性紅、亞甲基藍(lán)、聯(lián)芐吡啶、二磺酸蒽醌、Fe(OH)3和甲基紫精等。二磺酸蒽醌常用作腐殖酸的類似物，用于研究醌類物質(zhì)在電子傳遞中的作用。外源添加還原性的二黃酸蒽醌可以改變Clostridium beijerinckii的代謝模式，提高H2的產(chǎn)量。Fe(OH)3是最常用的氫氧化物，在厭氧發(fā)酵中是良好的電子載體；甲基紫精同鐵氧化還原蛋白的電勢(shì)相似，可以參與一系列生化反應(yīng)過程中的電子傳遞過程，通過鐵氧化還原蛋白-NAD還原酶增強(qiáng)NAD(P)+的電子流。

1979年，Hongo等[37]首次提出了“電子能方法”(Electroenergizing) 的概念，他們向黃色短桿菌Brevibacterium flavum菌發(fā)酵液中添加中性紅 (電子載體)，發(fā)現(xiàn)谷氨酸的產(chǎn)量明顯提高，而且從陰極傳遞的電子幾乎全部被宿主細(xì)胞吸收。遺憾的是，他們并沒有深入研究這些電子如何進(jìn)入生化代謝途徑。Yarlagadda等[38]通過外源添加甲基紫精，使得Clostridium sp. BC1的乙醇和丁醇產(chǎn)量分別提高了28倍和12倍，同時(shí)菌體對(duì)于丁醇等物質(zhì)的耐受性明顯提升。Liu等[39]認(rèn)為這些物質(zhì)與胞內(nèi)的NADPH/NADP+和NADH/NAD+總比例有著直接的聯(lián)系，NADPH/NADP+和NADH/NAD+總比例是主導(dǎo)胞內(nèi)代謝狀態(tài)的最主要因素。生物信息數(shù)據(jù)庫(kù)KEGG中包括855和1 064個(gè)氧化還原反應(yīng)，分別有106和88種以NAD+和NADP+為輔因子的酶催化反應(yīng) (到2012年10月為止)，幾乎涉及所有細(xì)胞骨架類化合物的構(gòu)建 (如氨基酸、脂類和核酸)。通過改變胞內(nèi)NADH的水平可以實(shí)現(xiàn)胞內(nèi)代謝流的調(diào)控，提高目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)量，增強(qiáng)菌體的抑制物耐受性[40-42]。

遺憾的是，目前對(duì)于發(fā)酵促進(jìn)劑的研究，主要集中于抑制物耐受機(jī)理的闡明[43-46]，實(shí)驗(yàn)過程中多采用合成培養(yǎng)基，而實(shí)際生產(chǎn)方面的應(yīng)用幾乎沒有開展?；诖?，我們率先開展了電子載體物質(zhì)、氧化還原物質(zhì)[47]與木質(zhì)纖維素抑制物原位脫毒關(guān)聯(lián)性的研究，利用秸稈水解液進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，取得了良好的發(fā)酵結(jié)果；首次提出了“發(fā)酵促進(jìn)劑設(shè)計(jì)技術(shù)”理念，綜合運(yùn)用前體工程、理論化學(xué)、計(jì)算化學(xué)和計(jì)算機(jī)輔助模擬等手段，構(gòu)建出促進(jìn)劑開發(fā)平臺(tái)技術(shù)，為傳統(tǒng)的發(fā)酵工藝提出了新的研究思路。其主要內(nèi)容為：首先，運(yùn)用組合化學(xué)手段，對(duì)已有的發(fā)酵促進(jìn)劑進(jìn)行歸類分析，獲取其決定作用的“母核”，然后運(yùn)用虛擬組合庫(kù)進(jìn)行大通量篩選。虛擬組合庫(kù)主要出自3個(gè)來源：一種是基于分子片段的直接枚舉而產(chǎn)生的新的分子庫(kù)；一種是基于反合成分析原理的片段化及重組而產(chǎn)生的新分子庫(kù)；另一種是基于分子構(gòu)象疊合和遺傳算法中的雜交原理的分子重組而產(chǎn)生的新的分子。目前，已經(jīng)成功完成了系列產(chǎn)品的研發(fā)，即將進(jìn)行實(shí)際發(fā)酵的生產(chǎn)驗(yàn)證。

4 展望

發(fā)酵抑制物制約著木質(zhì)纖維素的發(fā)酵效率，是木質(zhì)纖維素生物煉制的主要瓶頸?，F(xiàn)有的物理法、化學(xué)法、生物法等方法，只適用于特定抑制物的去除，而且投入成本較高，難以實(shí)現(xiàn)木質(zhì)纖維素的大規(guī)模發(fā)酵。隨著抑制物耐受機(jī)理研究的日益深入和以合成生物學(xué)為代表的菌種改造技術(shù)的成熟，抑制物耐受菌株的理性構(gòu)建將成為可能，同時(shí)發(fā)展“高效、清潔、低成本”的抑制物解除工藝，必將助力于木質(zhì)纖維素的大規(guī)模生產(chǎn)。筆者認(rèn)為，充分結(jié)合原料的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，發(fā)展“分級(jí)轉(zhuǎn)化”煉制模式，從源頭降低抑制物的產(chǎn)生，將是今后木質(zhì)纖維原料預(yù)處理的發(fā)展趨勢(shì)。“分級(jí)轉(zhuǎn)化”煉制模式為木質(zhì)纖維素的產(chǎn)業(yè)化提供了全新的思路和工藝“范本”，將對(duì)生物質(zhì)煉制產(chǎn)業(yè)的發(fā)展起到推動(dòng)作用。

REFERENCES

[1] Chen HZ. Biomass Science and Engineering. Beijing: Chemical Industry Press, 2008 (in Chinese).陳洪章. 生物質(zhì)科學(xué)與工程. 北京: 化學(xué)工業(yè)出版社, 2008.

[2] Chen HZ. Theory and Application of Value Added Utilization of Straw. Beijing: Chemical Industry Press, 2006 (in Chinese).陳洪章. 秸稈資源生態(tài)高值化理論與應(yīng)用. 北京: 化學(xué)工業(yè)出版社, 2006.

[3] Yang SH. Plant Fiber Chemistry. Beijing: China Light Industry Press, 2001 (in Chinese).楊淑蕙. 植物纖維化學(xué). 北京: 中國(guó)輕工業(yè)出版社, 2001.

[4] Chen H, Li G, Li H. Novel pretreatment of steam explosion associated with ammonium chloride preimpregnation. Bioresour Technol, 2014, 153: 154–159.

[5] Almeida JR, Modig T, Petersson A, et al. Increased tolerance and conversion of inhibitors in lignocellulosic hydrolysates by Saccharomyces cerevisiae. J Chem Technol Biot, 2007, 82(4): 340–349.

[6] Palmqvist E, Hahn-Hagerdal B. Fermentation of lignocellulosic hydrolysates. II: inhibitors and mechanisms of inhibition. Bioresour Technol, 2000, 74(1): 25–33.

[7] Taherzadeh M, Gustafsson L, Niklasson C, et al. Physiological effects of 5-hydroxymethylfurfural on Saccharomyces c erevisiae. Appl Microbiol Biot, 2000, 53(6): 701–708.

[8] Ando S, Arai I, Kiyoto K, et al. Identification of aromatic monomers in steam-exploded poplar and their influences on ethanol fermentation by Saccharomyces cerevisiae. J Biosci Bioeng, 1986,64(6): 567–570.

[9] Li H, Chen H. Detoxification of steam-exploded corn straw produced by an industrial-scale reactor. Process Biochem, 2008, 43(12): 1447–1451.

[10] Converti A, Dominguez JM, Perego P, et al. Wood hydrolysis and hydrolyzate detoxification for subsequent xylitol production. Chem Eng Technol, 2000, 23(11): 1013–1020.

[11] Palmqvist E, Hahn-H?gerdal B. Fermentation of lignocellulosic hydrolysates. I: inhibition and detoxification. Bioresour Technol, 2000, 74(1): 17–24.

[12] Nilvebrant NO, Reimann A, Larsson S, et al. Detoxification of lignocellulose hydrolysates with ion-exchange resins. Appl Biochem Biotech, 2001, 91(1/9): 35–49.

[13] Ang?n D, Altintig E, K?se TE. Influence of process parameters on the surface and chemical properties of activated carbon obtained from biochar by chemical activation. Bioresour Technol, 2013, 148: 542–549.

[14] Cheng KK, Cai BY, Zhang JA, et al. Sugarcane bagasse hemicellulose hydrolysate for ethanol production by acid recovery process. Biochem Eng J, 2008, 38(1): 105–109.

[15] Qureshi N, Ezeji TC, Ebener J, et al. Butanol production by Clostridium beijerinckii. Part I: Use of acid and enzyme hydrolyzed corn fiber. Bioresour Technol, 2008, 99(13): 5915–5922.

[16] Leonard RH, Hajny GJ. Fermentation of wood sugars to ethyl alcohol. Ind Eng Chem, 1945, 37(4): 390–395.

[17] Xue J, Pu H, Sun CB. Methods of the elimination of the inhibitors in the lignocellulosic hydrolysates. J Cell Sci Technol, 2004, 12(3): 48–53 (in Chinese).薛珺, 蒲歡, 孫春寶. 纖維素稀酸水解產(chǎn)物中發(fā)酵抑制物的去除方法. 纖維素科學(xué)與技術(shù), 2004, 12(3): 48–53.

[18] J?nsson L, Palmqvist E, Nilvebrant NO, et al. Detoxification of wood hydrolysates with laccase and peroxidase from the white-rot fungus Trametes versicolor. Appl Microbiol Biot, 1998, 49(6): 691–697.

[19] Cho DH, Lee YJ, Um Y, et al. Detoxification of model phenolic compounds in lignocellulosic hydrolysates with peroxidase for butanol production from Clostridium b eijerinckii. Appl Microbiol Biot, 2009, 83(6): 1035–1043.

[20] Palmqvist E, Hahn-H?gerdal B, Szengyel Z, et al. Simultaneous detoxification and enzyme production of hemicellulose hydrolysates obtained after steam pretreatment. Enzyme Microb Technol, 1997, 20(4): 286–293.

[21] Zhang YZ, Fu XG, Chen HZ. Pretreatment based on two-step steam explosion combined with an intermediate separation of fiber cells-optimization of fermentation of corn straw hydrolysates. Bioresour Technol, 2012, 121: 100–104.

[22] Mao SM, Zhang HY. Study on screening the butanol-tolerant mutant of Clostridium acetobutylicum and its physiological characteristics. J Central South Univ For Technol, 2012, 32(8): 103–107 (in Chinese).毛紹名, 章懷云. 丙酮丁醇梭菌高耐丁醇突變株的選育及其生理特性的研究. 中南林業(yè)科技大學(xué)學(xué)報(bào), 2012, 32(8): 103–107.

[23] Ding MZ, Zhou X, Yuan YJ. Metabolome profiling reveals adaptive evolution of Saccharomyces cerevisiae during repeated vacuum fermentations. Metabolomics, 2010, 6(1): 42–55.

[24] Keating JD, Panganiban C, Mansfield SD. Tolerance and adaptation of ethanologenic yeasts to lignocellulosic inhibitory compounds. Biotechnol Bioeng, 2006, 93(6): 1196–1206.

[25] Liu ZL, Slininger PJ, Gorsich SW. Enhanced biotransformation of furfural and hydroxymethylfurfural by newly developed ethanologenic yeast strains. the 26th Symposium on Biotechnology for Fuels and Chemicals. Totowa: Humana Press, 2005: 451–460.

[26] Yang XX. Genome-wide study for genes involved in furfural tolerance in Saccharomyces cerevisiae [D]. Tianjin: Tianjin University, 2012 (in Chinese).楊雪雪. 釀酒酵母基因組中糠醛耐受相關(guān)基因的初步研究[D]. 天津: 天津大學(xué), 2012.

[27] Li BZ, Cheng JS, Qiao B, et al. Genome-wide transcriptional analysis of Saccharomyces cerevisiae during industrial bioethanol fermentation. J Ind Microbiol Biot, 2010, 37(1): 43–55.

[28] Gorsich S, Dien B, Nichols N, et al. Tolerance to furfural-induced stress is associated with pentosephosphate pathway genes ZWF 1, GND 1, RPE 1, and TKL 1 in Saccharomyces c erevisiae. Appl Microbiol Biot, 2006, 71(3): 339–349.

[29] Chen HZ, Sun FB. Novel bioconversion of wheat straw to bio-organic fertilizer in a solid-state bioreactor. Bioproc Biosyst Eng, 2007, 30(2): 99–105.

[30] Li DM, Chen HZ. Biological hydrogen production from steam-exploded straw by simultaneous saccharification and fermentation. Int J Hydrogen Energ, 2007, 32(12): 1742–1748.

[31] Chen HZ, Han YJ, Xu J. Simultaneous saccharification and fermentation of steam exploded wheat straw pretreated with alkaline peroxide. Process Biochem, 2008, 43(12): 1462–1466.

[32] Chen HZ. Process Engineering in Plant-Based Products. Beijing: Chemicaly Industry Press, 2010 (in Chinese).陳洪章. 生物基產(chǎn)品過程工程. 北京: 化學(xué)工業(yè)出版社, 2010.

[33] Chen H, Qiu W. Key technologies for bioethanol production from lignocellulose. Biotechnol Adv, 2010, 28(5): 556–562.

[34] Zhao J, Chen H. Correlation of porous structure, mass transfer and enzymatic hydrolysis of steam exploded corn stover. Chem Eng Sci, 2013, 104: 1036–1044.

[35] Chen HZ, Wang L. Biomass Biochemical Conversion Technology. Beijing: Metallurgical Industry Press, 2012 (in Chinese).陳洪章, 王嵐. 生物質(zhì)生化轉(zhuǎn)化技術(shù). 北京: 冶金工業(yè)出版社, 2012.

[36] Wang L, Chen H. Increased fermentability of enzymatically hydrolyzed steam-exploded corn stover for butanol production by removal of fermentation inhibitors. Process Biochem, 2011, 46(2): 604–607.

[37] Hongo M, Iwahara M. Determination of electro-energizing conditions for L-glutamic acid fermentation. Agric Biol Chem, 1979, 43: 2083–2086.

[38] Yarlagadda VN, Gupta A, Dodge CJ, et al. Effect of exogenous electron shuttles on growth and fermentative metabolism in Clostridium sp. BC1. Bioresour Technol, 2012, 108: 295–299.

[39] Liu CG, Xue C, Lin YH, et al. Redox potential control and applications in microaerobic and anaerobic fermentations. Biotechnol Adv, 2013, 31(2): 257–265.

[40] Doi Y, Shimizu M, Fujita T, et al. Achromobacter denitrificans YD35 pyruvate dehydrogenase controls NADH production to tolerate extremely high nitrite levels. Appl Environ Microbiol, 2014, 80(6): 1910–1918.

[41] Kang TS, Korber DR, Tanaka T. Influence of oxygen on NADH recycling and oxidative stress resistance systems in Lactobacillus pa nis PM1. AMB Express, 2013, 3(1): 1–9.

[42] Jonsson LJ, Alriksson B, Nilvebrant NO. Bioconversion of lignocellulose: inhibitors and detoxification. Biotechnol Biofuels, 2013, 6(1): 16.

[43] Zhao XQ, Bai FW. Zinc and yeast stress tolerance: Micronutrient plays a big role. J Biotechnol, 2012, 158(4): 176–183.

[44] Nabais RC, Sá-Correia I, Viegas CA, et al. Influence of calcium ion on ethanol tolerance of Saccharomyces bayanus and alcoholic fermentation by yeasts. Appl Environ Microbiol, 1988, 54(10): 2439–2446.

[45] Dombek KM, Ingram LO. Magnesium limitation and its role in apparent toxicity of ethanol during yeast fermentation. Appl Environ Microbiol, 1986, 52(5): 975–981.

[46] Sootsuwan K, Thanonkeo P, Keeratirakha N, et al. Sorbitol required for cell growth and ethanol production by Zymomonas mo bilis under heat, ethanol, and osmotic stresses. Biotechnol Biofuels, 2013, 6(1): 180.

[47] Wang L, Xia ML, Zhang L, et al. Promotion of the Clostridium ac etobutylicum ATCC 824 growth and acetone-butanol-ethanol fermentation by flavonoids. World J Microbiol Biotechnol, 2014: 1–8. DOI 10.1007/s11274–014–1619–y.

(本文責(zé)編 陳宏宇)

Application of process engineering to remove lignocellulose fermentation inhibitors

Lan Wang, Menglei Xia, and Hongzhang Chen
Beijing Key Laboratory of Biomass Refining Engineering, Institute of Process Engineering, Chinese Academy of Science, Beijing 100190, China

Fermentation inhibitors are toxic to cells, which is one of the bottlenecks for lignocellulose bio-refinery process. How to remove those inhibitors serves a key role in the bioconversion of lignocellulose. This article reviews the sources and the types of the inhibitors, especially the updated removal strategies including physical methods, chemical methods, biological methods and inhibitor-tolerant strain construction strategies. Based on these, we introduce a new bio-refinery model named“fractional conversion”, which reduces the production of inhibitors at pretreatment stage, and a novel in situ detoxification method named “fermentation promoter exploitation technology”. This review could provide new research ideas on the removal of fermentation inhibitors.

lignocellulose, fermentation inhibitors, reducing inhibitors from the very beginning, fractional conversion, fermentation promoter

January 27, 2014; Accepted: March 10, 2014

Hongzhang Chen. Tel/Fax: +86-10-82627071; E-mail: hzchen@ipe.ac.cn

王嵐, 夏夢(mèng)雷, 陳洪章. 過程工程在木質(zhì)纖維素發(fā)酵抑制物解除中的應(yīng)用. 生物工程學(xué)報(bào), 2014, 30(5): 716–725.

Wang L, Xia ML, Chen HZ. Application of process engineering to remove lignocellulose fermentation inhibitors. Chin J Biotech, 2014, 30(5): 716–725.

Supported by: Special Funds of the Science and Technology Innovation Base for Beijing Key Laboratory of Biomass Refining Engineering (No. Z13111000280000), National High Technology Research and Development Program (863 Program) (No. 2012AA021302), National Basic Research Program of China (973 Program) (No. 2011CB707401).

生物質(zhì)煉制工程北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室2013年度科技創(chuàng)新基地培育與發(fā)展工程專項(xiàng)項(xiàng)目 (No. Z13111000280000), 國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃 (863計(jì)劃) (No. 2012AA021302), 國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃 (973計(jì)劃) (No. 2011CB707401) 資助。

時(shí)間：2014-04-01 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/doi/10.13345/j.cjb.140063.html