伍巧源，廖蘊(yùn)華，楊楨華，郭 誼，周穎川，陳一強(qiáng)

(廣西醫(yī)科大學(xué)：1.第一附屬醫(yī)院腎內(nèi)科，2.研究生院，3.第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，4.第一附屬醫(yī)院病理科，5.第一附屬醫(yī)院呼吸科，廣西南寧 530021)

腎素抑制劑阿利吉侖對(duì)阿霉素腎病小鼠腎損傷及足細(xì)胞nephrin表達(dá)的影響

伍巧源1，2，廖蘊(yùn)華1，楊楨華1，郭 誼3，周穎川4，陳一強(qiáng)5

(廣西醫(yī)科大學(xué)：1.第一附屬醫(yī)院腎內(nèi)科，2.研究生院，3.第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，4.第一附屬醫(yī)院病理科，5.第一附屬醫(yī)院呼吸科，廣西南寧 530021)

目的觀察腎素抑制劑阿利吉侖對(duì)阿霉素腎病小鼠腎損傷的保護(hù)作用及對(duì)足細(xì)胞nephrin表達(dá)的影響。方法通過尾靜脈注射阿霉素建立小鼠阿霉素腎病模型后給予阿利吉侖，另設(shè)正常對(duì)照組及阿霉素腎病對(duì)照組；比較不同組別尿蛋白及腎功能的差異；腎組織石蠟切片行PAS、HE和Masson染色，觀察各組腎小球硬化程度和腎小管損害程度。RT-PCR及Western blot檢測(cè)各組nephrin的表達(dá)。結(jié)果阿霉素腎病小鼠表現(xiàn)為蛋白尿、低蛋白血癥并伴有進(jìn)行性腎功能下降，病理表現(xiàn)為腎小球硬化及小管間質(zhì)損害；阿利吉侖可使蛋白尿狀況顯著改善，血清白蛋白上升，腎功能惡化得以延緩(P＜0.05)，腎小球硬化和小管間質(zhì)損害程度明顯改善(P＜0.05)。阿霉素腎病小鼠nephrin mRNA及蛋白表達(dá)水平均顯著低于正常對(duì)照組，給予阿利吉侖干預(yù)后nephrin mRNA及蛋白表達(dá)水平有顯著上升(P＜0.05)。結(jié)論阿利吉侖對(duì)小鼠阿霉素腎病有良好的保護(hù)作用，該作用至少部分與其上調(diào)腎小球足細(xì)胞nephrin的表達(dá)有關(guān)。

腎素抑制劑；阿利吉侖；阿霉素腎病；足細(xì)胞；nephrin

腎素-血管緊張素系統(tǒng)(renin-angiotensin system，RAS)過度激活是腎臟疾病發(fā)生發(fā)展的重要機(jī)制之一，抑制RAS系統(tǒng)是治療腎臟病的有效途徑。但是由于RAS系統(tǒng)的負(fù)反饋調(diào)節(jié)機(jī)制，應(yīng)用血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑(angiotensin-converting enzyme inhibitor，ACEI))或血管緊張素受體阻斷劑(angiotensin receptor blocker，ARB)會(huì)使體內(nèi)腎素和血管緊張素(angiotensin，AngⅡ)代償性增加，這種對(duì)RAS的不完全阻斷作用限制了ACEⅠ或ARB的腎臟保護(hù)作用。阿利吉侖是新型腎素抑制劑，可阻斷RAS的初始步驟，使AngⅠ、AngⅡ水平明顯減低，能更徹底地阻斷RAS系統(tǒng)；很多研究已經(jīng)表明該藥在保護(hù)腎臟方面有其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。但目前研究主要集中于阿利吉侖對(duì)糖尿病腎病的保護(hù)作用［1］。本文通過建立小鼠阿霉素腎病模型，觀察阿利吉侖對(duì)該模型尿蛋白及腎臟病理改變的影響，及對(duì)足細(xì)胞nephrin表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 小鼠阿霉素腎病模型的建立、分組與取材18只8周齡、雄性BALB/c小鼠分為3組：分別為正常對(duì)照組、阿霉素組及阿霉素+阿利吉侖治療組(后2組均一次性尾靜脈注射阿霉素(10 mg/kg)建立小鼠阿霉素腎病模型；之后阿霉素+阿利吉侖治療組給予阿利吉侖［3 mg/(kg·d)，瑞士諾華制藥有限公司］灌胃。正常對(duì)照組一次性尾靜脈注射等量生理鹽水。阿霉素注射后第6周所有小鼠行24 h尿蛋白定量測(cè)定；心臟穿刺取血標(biāo)本，測(cè)血清血肌酐、總蛋白、白蛋白和膽固醇。隨后處死小鼠。部分腎組織以100 m L/L甲醛固定，石蠟包埋；其余腎組織液氮冷凍，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 腎臟組織學(xué)常規(guī)檢查腎組織石蠟切片行PAS、HE和Masson染色，觀察腎組織腎小球硬化程度和腎小管損害程度。腎小球硬化定義為在一毛細(xì)血管襻節(jié)段內(nèi)出現(xiàn)PAS染色陽(yáng)性物質(zhì)引起的系膜區(qū)擴(kuò)張、球囊粘連和毛細(xì)血管襻塌陷。腎小球硬化程度按0～4分的半定量計(jì)分方法評(píng)價(jià)：無(wú)硬化改變?yōu)?分；硬化占整個(gè)腎小球面積的25%以下為1分；占整個(gè)腎小球面積的26%～50%為2分；占整個(gè)腎小球面積的51%～75%為3分；占整個(gè)腎小球面積的76%～100%為4分。每只小鼠腎小球硬化的最終評(píng)分為所評(píng)價(jià)的小鼠所有腎小球計(jì)分的平均值。每只小鼠至少評(píng)價(jià)30個(gè)腎小球，結(jié)果表示為均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤，評(píng)分采用盲法。腎小管間質(zhì)的損傷定義為近端小管刷狀緣消失、腎小管擴(kuò)張、萎縮以及間質(zhì)纖維化形成，按程度以0～4分的半定量計(jì)分方法評(píng)價(jià)：正常為0分；小管間質(zhì)損害＜25%1分；小管間質(zhì)損害25%～50%為2分；小管間質(zhì)損害51%～75%3分；小管間質(zhì)損害＞75%為4分。每只小鼠至少評(píng)價(jià)30個(gè)連續(xù)非重疊的皮質(zhì)區(qū)高倍鏡下視野(×400)，最終評(píng)分由所有高倍鏡下視野計(jì)分的平均值得出，結(jié)果表示為均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤，評(píng)分采用盲法。

1.3 RT-PCR檢測(cè)腎組織nephrin mRNA的表達(dá)Trizol法提取腎皮質(zhì)總RNA，取2μg RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。nephrin正義引物、反義引物序列分別為5'-GGGGACCCCTCTATGATGAA-3'、5'-GTGAAGCGTCTCACACCAGA-3'，產(chǎn)物為171 bp。GAPDH正義引物、反義引物序列分別為5'-CTACCCCCAATGTGTCCGTC-3'、5'-AGCCCAAGATGCCCTRCAGT-3'，產(chǎn)物為120 bp。經(jīng)15 g/L瓊脂糖凝膠電泳后用凝膠成像系統(tǒng)(Alpha Innotech，USA)分析檢測(cè)電泳圖像吸光度值，以nephrin和內(nèi)參照GAPDH的吸光度之比作為檢測(cè)指標(biāo)的相對(duì)表達(dá)量。

1.4 免疫印跡測(cè)定足細(xì)胞nephrin的表達(dá)用含10 g/L蛋白酶抑制劑的PLC細(xì)胞裂解液提取腎組織總蛋白，Bradford法進(jìn)行蛋白定量后，50μg上樣于100 g/L SDS分離膠電泳，轉(zhuǎn)膜后用含50 g/L脫脂奶粉的TBST室溫封閉1 h，加相應(yīng)一抗(Abcam公司，1∶500稀釋)于4℃培育過夜后，辣根過氧化物酶耦聯(lián)的二抗室溫培育1 h；與ECL顯色劑反應(yīng)1 min，曝光顯影。結(jié)果應(yīng)用凝膠成像系統(tǒng)(Alpha Innotech，USA)分析；以GAPDH為內(nèi)參照，所檢測(cè)蛋白與之的比值作為該蛋白表達(dá)的相對(duì)值。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。組間均數(shù)比較采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件行方差(ANOVA)分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05。

2 結(jié) 果

2.1 各組小鼠尿與血生化指標(biāo)的檢測(cè)結(jié)果相比于正常對(duì)照組，單純給予阿霉素后小鼠出現(xiàn)明顯的蛋白尿、低蛋白血癥、高膽固醇血癥并伴有進(jìn)行性腎功能下降；但阿霉素注射后再給予阿利吉侖則小鼠上述情況總體得到明顯改善：尿蛋白減少，血清白蛋白上升，血清肌酐則明顯下降；但對(duì)膽固醇的影響則不明顯(表1)。

表1 各組小鼠蛋白尿與血生化指標(biāo)的比較Tab.1 Comparison of proteinuria and blood biochemistry among all groups

2.2 各組小鼠腎臟組織學(xué)的病理改變與正常對(duì)照組比較，單純注射阿霉素6周后小鼠腎臟組織學(xué)改變包括進(jìn)展性局灶節(jié)段腎小球硬化、腎間質(zhì)廣泛纖維化和腎小管萎縮。而阿利吉侖可顯著改善阿霉素導(dǎo)致的上述病理改變(P＜0.05，表2，圖1)。

2.3 各組腎組織足細(xì)胞nephrin mRNA及蛋白表達(dá)單純阿霉素腎病小鼠nephrin m RNA的水平較正常對(duì)照組明顯下降(P＜0.05)，但給予阿利吉侖干預(yù)后nephrin mRNA表達(dá)顯著回升(P＜0.05)。腎組織nephrin蛋白表達(dá)亦具有類似的變化趨勢(shì)(圖2、圖3)。

表2 阿利吉侖對(duì)阿霉素腎病小鼠腎組織病理?yè)p害的影響Tab.2 Effects of aliskiren on renal histology of mice with adriamycin nephropathy

圖1 阿利吉侖對(duì)阿霉素腎病小鼠腎臟病理?yè)p害的影響Fig.1 Effects of aliskiren on renal histology of mice with adriamycin nephropathy(Masson staining，×200)

圖2 各組nephrin mRNA的表達(dá)Fig.2 Expression of nephrin mRNA in each group

圖3 各組腎組織nephrin蛋白的表達(dá)Fig.3 Expression of nephrin protein in each group

3 討 論

大量研究已經(jīng)證實(shí)RAS系統(tǒng)阻斷劑可延緩慢性腎臟病的進(jìn)展，如COOPERATE［2］及RENAAL等［3］研究已證實(shí)ACEI或ARB類藥物能延緩慢性腎臟病的進(jìn)展。但目前常用的RAS抑制劑有其不足之處：長(zhǎng)期應(yīng)用ACEI可導(dǎo)致“血管緊張素Ⅱ逃逸”現(xiàn)象；ARB類藥物則可導(dǎo)致血管緊張素Ⅱ型受體(AT2)的激活，AT2的過度激活能導(dǎo)致心臟肥大和血管纖維化等不良后果。且ACEI和ARB均可升高血漿腎素活性，血漿腎素活性升高是導(dǎo)致高血壓患者心梗的危險(xiǎn)因素，還與腎功能不全密切相關(guān)。直接腎素抑制劑阿利吉侖可阻斷RAS系統(tǒng)首步反應(yīng)的限速酶，可更徹底的抑制RAS系統(tǒng)，避免血管緊張素Ⅱ逃逸現(xiàn)象，不會(huì)激活任何亞型的血管緊張素受體?；诎⒗獊龅纳鲜鎏攸c(diǎn)，自該藥面世以來，其對(duì)腎臟的保護(hù)作用即被密切關(guān)注。但該藥與腎臟病的關(guān)系研究目前主要集中于糖尿病繼發(fā)腎損害。研究發(fā)現(xiàn)其可減少糖尿病腎病的蛋白尿，延緩腎小球硬化進(jìn)展；且有報(bào)道其抑制間質(zhì)纖維化的作用要強(qiáng)于ACEI［4-6］。本研究利用小鼠阿霉素腎病模型觀察阿利吉侖的腎臟保護(hù)作用，結(jié)果顯示小鼠阿霉素腎病模型類似于人類的局灶節(jié)段性腎小球硬化；病理學(xué)特征性表現(xiàn)為進(jìn)展性腎小球硬化及小管間質(zhì)損害等［7］，是研究人類腎小球疾病的重要模型之一。本實(shí)驗(yàn)給予阿霉素注射6周后小鼠表現(xiàn)出以蛋白尿、低蛋白血癥、高脂血癥和腎功能損害為特征的阿霉素腎?。徊±盹@示阿霉素導(dǎo)致小鼠出現(xiàn)進(jìn)展性腎小球硬化和腎小管間質(zhì)損害。相比于單純給予阿霉素，給予阿霉素后再給予阿利吉侖干預(yù)，尿蛋白則顯著改善，血清白蛋白上升，明顯延緩了腎功能惡化；并可較為明顯地減輕腎小球硬化和腎小管間質(zhì)損害；提示阿利吉侖對(duì)阿霉素腎損害有良好的保護(hù)作用。

RAS系統(tǒng)阻斷劑延緩慢性腎臟病的進(jìn)展一方面是通過改善腎小球血流動(dòng)力學(xué)；另一方面，除已經(jīng)證實(shí)的通過抑制促細(xì)胞外基質(zhì)合成因子及抑制抗細(xì)胞外基質(zhì)降解因子而抑制間質(zhì)纖維化，還包括介導(dǎo)和參與足細(xì)胞的保護(hù)作用。足細(xì)胞具有AngⅡ的1型受體(ATR1)［8］，并在應(yīng)激時(shí)表達(dá)上調(diào)［9］；由AT1受體傳遞的強(qiáng)化信號(hào)可導(dǎo)致足細(xì)胞損傷，蛋白漏出，激活相關(guān)化學(xué)因子和細(xì)胞因子，最終引起間質(zhì)纖維化和腎功能的喪失。因此，作者進(jìn)一步對(duì)阿利吉侖降低蛋白尿，改善腎組織損害等腎臟保護(hù)作用是否與足細(xì)胞相關(guān)進(jìn)行研究。nephrin是足細(xì)胞分泌產(chǎn)生的對(duì)維持足突結(jié)構(gòu)及裂孔膜的完整性具有重要作用的蛋白，nephrin表達(dá)減少，將影響腎小球?yàn)V過膜的完整性，導(dǎo)致蛋白尿的產(chǎn)生。本研究發(fā)現(xiàn)注射阿霉素后小鼠腎組織nephrin m RNA及蛋白表達(dá)均顯著減少，而給予阿利吉侖干預(yù)后，阿霉素導(dǎo)致的小鼠nephrin m RNA及蛋白表達(dá)下調(diào)的現(xiàn)象得到明顯改善。提示阿利吉侖可以上調(diào)nephrin m RNA及蛋白表達(dá)，起到修復(fù)足細(xì)胞損傷的作用，從而維持足細(xì)胞正常功能。新近亦已有少量研究提示阿利吉侖對(duì)足細(xì)胞有保護(hù)作用：如PHILLIPS［10］發(fā)現(xiàn)阿利吉侖可下調(diào)高糖環(huán)境下小鼠足細(xì)胞的凋亡；RASHIKH［11］應(yīng)用電鏡觀察阿霉素腎病大鼠腎小球超微結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，阿霉素可導(dǎo)致足細(xì)胞足突基部寬度增加以及足細(xì)胞裂孔直徑減小，而阿利吉侖可明顯改善阿霉素導(dǎo)致的足突基部增寬及裂孔直徑減小。還有報(bào)道發(fā)現(xiàn)阿利吉侖可改善轉(zhuǎn)腎素基因大鼠蛋白尿的同時(shí)，亦可上調(diào)其足細(xì)胞podocin的表達(dá)［12］。這些均提示阿利吉侖對(duì)阿霉素導(dǎo)致的小鼠腎損害具有保護(hù)作用，可能部分與其對(duì)足細(xì)胞的保護(hù)作用相關(guān)。

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(編輯 國(guó) 榮)

Effects of renin inhibitor aliskiren on adriamycin nephropathy and nephrin expression in podocytes in mice

WU Qiao-yuan1，2，LIAO Yun-hua1，YANG Zhen-hua1，GUO Yi3，ZHOU Ying-Chuan4，CHEN Yi-qiang5
(1.Department of Nephrology，the First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University，2.Graduate School，Guangxi Medical University，3.Department of Clinical Laboratory，the First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University，4.Department of Pathology，the First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University，5.Institute of Respiratory Disease，the First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University，Nanning 530021，China)

ObjectiveTo study the effects of renin inhibitor aliskiren on adriamycin nephropathy and nephrin expression in podocytes in mice.MethodsMale BALB/c mice were subjected to a single tail vein injection of adriamycin to establish the model of adriamycin nephropathy.Then mice were treated with aliskiren；24-hour urine samples were collected for measurement of urinary protein.Mice were sacrificed at week 6.The paraffin-embedded sections of their kidneys were stained by PAS，Masson and HE staining.The expressions of nephrin m RNA and protein were determined by RT-PCR and Western blot.ResultsAdriamycin nephropathy in mice was characterized by proteinuria，increased serum creatinine，progressive glomerulosclerosis，and tubulointerstitial lesions.Aliskiren could lessen proteinuria and serum creatinine significantly and alleviate the above histologic lesions significantly(P＜0.05).Mice with only adriamycin nephropathy showed a significant decrease of nephrin m RNA and protein expressions.Yet，Aliskiren could improve the decreased expression of nephrin m RNA and protein induced by adriamycin(P＜0.05).ConclusionRenin inhibitor aliskiren can protect against adriamycin nephropathy in mice，which may be partly related to its upregulating the expression of nephrin in podocytes.

renin inhibitor；aliskiren；adriamycin nephropathy；podocyte；nephrin

R692

A

1671-8259(2014)05-0665-04

10.7652/jdyxb201405019

2013-12-26

2014-03-20

廣西自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.2010GXNSFA013183) Supported by Guangxi Natural Science Foundation(No.2010GXNSFA013183)

廖蘊(yùn)華，教授.E-mail：yunhualiao1008@aliyun.com

伍巧源(1973-)，女(壯族)，副主任醫(yī)師，博士學(xué)位，碩士生導(dǎo)師.研究方向：腎小球疾病.E-mail：236071507@qq.com

時(shí)間：2014-07-22 16∶22 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/61.1399.R.20140728.1737.001.html