孟 浩 彭 貞 王 闖 劉瑞蘭 高慶華

RNA分子的提取是分子生物學研究中一項的基本內容，是進行基因表達分析的基礎［1］。隨著分子生物學技術的迅猛發(fā)展及在醫(yī)學領域中的普及，以RNA為研究對象的分子生物學實驗與日俱增。外周血作為常用的理想實驗材料，由于取材方便，且不需組織勻漿等客觀因素的影響，可用作分子印跡和病毒學研究的對象［2］，而被廣泛應用。血液總RNA提取所采用的Trizol法常作為RNA提取的方法之一，這與Trizol試劑本身能有效的從細胞或組織中直接提取RNA，并且在實驗中降低血液中含有的RNA酶污染，防止RNA酶對RNA的降解有關。這也正是保證所得RNA片段完整的關鍵。

大量的研究實驗證明:雖然提取RNA的方法很多，但是其基本都是把細胞破碎以后，以除去材料中糖、蛋白質、DNA等雜質為目標。而且材料自身物理化學性質的不同，不同的材料需要不同的提取方法［3～5］。但在分離血液總RNA所采用的不同抗凝血液在實際運用的效果甚少。本文正是利用在不同抗凝血液和紅細胞裂解前后的對比。從而，獲得最佳質量總RNA和實用的提取方法。

1 材料與方法

1.1 材料

羊外周靜脈血，采自塔里木大學動物科學學院動物實驗站，分別用ACD和肝素鈉作為血液抗凝試劑。

1.2 試劑

DEPC水:1:1 000比例DEPC加入超純水。常溫下，磁力攪拌3～4 h，10～11 h靜置孵育，121℃、30 min滅活。

ACD:檸檬酸 4.8 g、檸檬酸鈉13.2 g、葡萄糖14.7 g定容于1 L的無酶水紅細胞裂解液:氯化銨8.29 g、碳酸氫鉀 1 g、EDTA 0.037 g定容于1 L 的無酶水Trizol試劑、氯仿、異丙醇、無水乙醇、75%乙醇無酶水配置。

1.3 方法

1.3.1 經(jīng)典Trizol法直接提取血液總RNA

取不同抗凝后的血樣0.5 mL放置于無RNA酶離心管中，加3倍體積Trizol，震蕩混勻，室溫靜置5 min;4℃，12 000 g/min，離心15 min。用移液器吸取上清，到另一無酶離心管，按照1 000μL Trizol體積加入200μL氯仿，渦旋15 s，靜置3 min;4℃，12 000 g/min，離心15 min。取上清450μL至干凈無酶1.5 mL離心管，按1000μL Trizol體積加入預冷的500μL異丙醇。混勻、室溫靜置10 min，4℃，12 000 g/min，離心15 min。小心吸棄上清，留管底沉淀，加入1 mL由DEPC水配置的75%乙醇，吹打混勻，4℃，8 000 g/min，離心5 min。棄上清，倒置于干凈的濾紙片刻，開蓋，揮發(fā)乙醇2～3 min，加入15μL DEPC水，吹打混勻，55℃ ～60℃水浴10 min，－70℃保存。

1.3.2 裂解法提取血液總RNA

1.3.2.1 裂解紅細胞

取0.5 mL抗凝血液，按1:3體積加入預冷紅細胞裂解液，混勻，室溫靜置10 min，4℃，10 000 r/min，離心1 min。小心棄去上清，保留管底細胞沉淀。

1.3.2.2 Trizol提取細胞總 RNA

向細胞沉淀的離心管中加入1.5 mL Trizol試劑，震蕩混勻，靜置5 min，再按照1 000μL Trizol體積加入200μL氯仿，其余處理方法與經(jīng)典Trizol法處理相同。

1.3.3 總RNA完整性和濃度檢測

取4μL總RNA與2μL 6×Loading Buffer混合后，點樣于1%(含有0.05μg/mL EB)瓊脂糖凝膠，150 V恒壓電泳進行檢測，15 min后在凝膠成像系統(tǒng)(美國，Bio－Rad公司)進行拍照檢測。

使用Thermo公司的NanoDrop2000c進行260 nm和280 nm偏振光檢測，估測RNA濃度和純度比值。根據(jù)RNA濃度=40μg·mL－1×稀釋倍數(shù)×Abs260nm計算出 RNA濃度。

2 結果與分析

2.1 總RNA樣品的1%瓊脂糖凝膠電泳

經(jīng)過凝膠成像系統(tǒng)拍照檢測。所得結果如下圖:

圖1 全血中直接提取RNA

圖2 裂解紅細胞后提取RNA

電泳結果顯示，在肝素鈉抗凝血液中，紅細胞裂解處理前后提取的總RNA，均有三條明顯亮帶，說明提取過程中，未發(fā)生RNA的降解，完整性好。而在采用ACD抗凝處理后的血液總RNA未能出現(xiàn)預期的三條帶型。

在肝素鈉抗凝的血液經(jīng)過裂解液處理后，總RNA帶型清晰、明確。28S的亮度大于18S。全血直接提取總RNA結果，在凝膠檢測時產生抹帶、拖尾現(xiàn)象。

在ACD抗凝血液采用兩種不同方法提取總RNA，經(jīng)電泳檢測之后，均出現(xiàn)條帶不完整，且?guī)湍：F(xiàn)象。

2.2 總RNA濃度檢測

使用Thermo公司的NanoDrop2000c進行260 nm和280 nm偏振光檢測，計算機自行算出總RNA濃度和A260/A280比值，得到表1、表2結果:

表1 未經(jīng)紅細胞裂解處理總RNA濃度和純度

表2 紅細胞裂解處理后總RNA濃度和純度

3 討論

在RNA的提取過程中，由于RNA核糖殘基帶有羥基，導致RNA比DNA化學性質更活躍，易被RNA酶降解，這就要求提取RNA的步驟盡可能減小RNA酶污染［6］。在本實驗中，RNA提取所用的儀器和槍頭都采取滅酶處理，實驗中勤換手套，杜絕由人為操作帶入外源RNA酶的污染，最終得到本實驗結果。在比較圖中處理前與處理后之間的差異可以看出:在經(jīng)過兩種方法分別提取總RNA的時候，直接提取的效果不如裂解紅細胞之后的效果。直接提取的總RNA出現(xiàn)相應程度抹帶和帶型不完整現(xiàn)象，這與淳俊等人［7］在用Trizol提取總RNA進行電泳檢測出現(xiàn)的帶型不完整現(xiàn)象相似。同時，28S的亮度也未出現(xiàn)大于18S亮度兩倍的情況，這可能與過多的細胞含有的內源性RNA酶對RNA的降解產生有關［8］。利用分光光度計對總RNA進行濃度和A260/A280值檢測中，發(fā)現(xiàn)兩種提取結果A260/A280的比值都在1.8～2.0之間。證明兩種方法提取總RNA純度較好，提取結果里未出現(xiàn)有蛋白的污染［9］，但總RNA的濃度差別較大，直接提取總RNA的濃度明顯小于通過裂解紅細胞后的總RNA濃度。由此推斷，血液中內源RNA酶是影響RNA提取產量至關重要的因素［10－11］。

另外，在對不同抗凝劑對總RNA提取的影響，我們也做了相關的研究。其中，在控制了電泳時間、凝膠孔徑大小等因素后，對采用不同抗凝劑后的血樣抽提RNA，在結果中我們發(fā)現(xiàn):經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳，肝素鈉抗凝的血液中，條帶的亮度明顯比ACD抗凝血液得到的條帶要亮，并且?guī)颓逦?、完整。但?jīng)過分光光度計檢測，濃度并無較大差別，這可能與謝勝松等［12］人所提出的利用瓊脂糖檢測RNA質量，其中稀釋與否和上樣量對RNA檢測有關。同時我們在對抗凝劑可能對RNA提取質量影響的研究中發(fā)現(xiàn)，在利用不同的抗凝劑對RNA的溶解也可產生一定的影響。例如Sung Jae kim等人研究了在不同抗凝劑貯存血液方式下，對提取RNA的質量有明顯的影響，在該研究中發(fā)現(xiàn)用檸檬酸鈉抗凝的血液，經(jīng)Trizol法提取后的RNA，在后期實驗中可用來做cDNA的合成，而ACD含有的成分主要是檸檬酸鈉;在肝素抗凝后的血液，在相同方法提取的RNA，可作為基因芯片的研究［13］。由此解釋了在采用不同抗凝劑處理后的血液，對RNA的提取質量有明顯的影響，尤其是對分子克隆、基因芯片等較高標準分子生物學研究中所提出的RNA完整性、純度、濃度等要求。

4 結論

在以綿羊血液為試材，利用經(jīng)典Trizol法對比兩種不同抗凝劑和紅細胞裂解前后處理外周血得到的總RNA效果，得出經(jīng)肝素鈉抗凝且紅細胞裂解液處理后外周血液的總RNA質量和純度最好，可作為分子生物學實驗后期較高標準的研究基礎。

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