韓春妮， 彥漢文， 吳盛友， 陳海豐， 林 青， 段小花

(云南中醫(yī)學(xué)院， 云南 昆明 650500)

天麻(GastrodiaelataBl.)是我國的名貴中藥，臨床多用于頭痛眩暈、肢體麻木、小兒驚風(fēng)、癲癇、抽搐、破傷風(fēng)等癥。作為道地藥材的云南昭通天麻有烏天麻(GastrodiaelataBl.f.glauca)、黃天麻(GastrodiaelataBl.f.flavida)和綠天麻(GastrodiaelataBl.f.viridis)三種變型。天麻主要含有酚類、有機(jī)酸類、含氮類、甾醇及多糖類化合物，其中天麻素、對羥基苯甲醇、對羥基苯甲醛和腺苷等化合物認(rèn)為是天麻的主要活性成分。但是《中國藥典》2010年版(一部)天麻含量測定項(xiàng)下，僅對天麻素做了相關(guān)規(guī)定[1]，為更加客觀、全面的評價云南昭通天麻質(zhì)量，對其進(jìn)行質(zhì)量控制，本研究建立了4個成分同時測定的HPLC方法，并對烏、綠、黃三種天麻變型進(jìn)行了含量分析和比較。

1 儀器與供試藥

安捷倫高效液相色譜儀，二級管陣列檢測器。天麻素、腺苷、對羥基苯甲醇和對羥基苯甲醛對照品(中國藥品生物制品檢定所提供)，烏天麻、黃天麻、綠天麻干品，均購于昭通天麻研究所，經(jīng)昭通天麻研究所陳順芳老師鑒定。甲醇為色譜純，醋酸為國產(chǎn)分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件及系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn) 色譜柱：Agilent TC-C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相A-甲醇，B-0.1%醋酸水溶液；線性梯度洗脫程序：0～30 min，5% A；30～35 min，20% A；35～55 min，25% A；流速：1.0 mL·min-1；檢測波長：270 nm；柱溫35℃；進(jìn)樣量20 μL。

在上述色譜條件下，天麻素、腺苷、對羥基苯甲醇和對羥基苯甲醛主色譜峰與相鄰其它色譜峰的分離度大于1.5，理論塔板數(shù)不低于5000。對照品和三種天麻樣品色譜圖見圖1。

1.天麻素；2.腺苷；3.對羥基苯甲醇；4.對羥基苯甲醛

2.2 對照品溶液的制備 分別精密稱取對照品天麻素、腺苷、對羥基苯甲醇和對羥基苯甲醛適量，置同一25 mL量瓶中，加10%甲醇適量使溶解并稀釋至刻度，搖勻，得質(zhì)量濃度分別為383，12.4，49.0，5.6 mg·L-1的混合對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備 取本品藥材粉末(過40目篩)約0.5 g，精密稱定，置圓底燒瓶中，精密加入蒸餾水20 mL，稱重，加熱回流提取1 h，放冷再稱重，用蒸餾水補(bǔ)足減失的質(zhì)量，離心。精密量取上清液5 mL于燒杯中，加入甲醇約20 mL，振搖3 min至白色絮狀沉淀產(chǎn)生完全，離心。上清液濃縮至近干，殘渣加10%甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至5 mL容量瓶中，并用10%甲醇稀釋至刻度，搖勻，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4 線性關(guān)系考察 分別精密量取混合對照品溶液0.5，1.0，2.5，4.0，5.0，10.0 mL置10 mL量瓶中，加10%甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得不同濃度的系列混合對照品溶液。在上述色譜條件下進(jìn)行分析，以峰面積Y對濃度X(mg·L-1)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得天麻素、腺苷、對羥基苯甲醇和對羥基苯甲醛的回歸方程和相應(yīng)的R2值分別為：y=14.792x-10.203，R2=0.998；y=1.017x-0.2569，R2=0.9975；y=4.2738x-1.0872，R2=0.9975；y=0.395x-0.1814，R2=0.9965。

結(jié)果表明天麻素、 腺苷、 對羥基苯甲醇和對羥基苯甲醛分的線性關(guān)系良好。

2.5 精密度試驗(yàn) 取同一混合對照品溶液，在上述色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄各自峰面積，計算天麻素、腺苷、對羥基苯甲醇和對羥基苯甲醛峰面積的RSD分別為1.4、1.1、1.4、1.1%。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取天麻(烏天麻)粉末0.5 g，按2.3項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，在上述色譜條件下進(jìn)行分析，計算含量。天麻素、腺苷、對羥基苯甲醇和對羥基苯甲醛含量的RSD分別為1.8，2.0，2.4，1.9%。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一份供試品溶液，室溫放置，分別在0，3，5，8，12，24 h進(jìn)樣分析，記錄各自峰面積，天麻素、腺苷、對羥基苯甲醇和對羥基苯甲醛峰面積的RSD分別為1.7，1.1，1.5，1.8%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 加樣回收率試驗(yàn) 稱取已知含量的烏天麻粉末9 份，3份為一組，每份0.25 g，精密稱定。分別精密加入對照品適量，按2.3項(xiàng)下方法制成低、中、高3個濃度的供試品溶液，進(jìn)樣分析。天麻素、腺苷、對羥基苯甲醇和對羥基苯甲醛平均回收率(n=9)結(jié)果見表1。

表1 四個成分的加樣回收率(n=9)

2.9 樣品含量測定 分別稱取各種天麻藥材粉末(過40目篩)約0.5 g，精密稱定，按2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在上述色譜條件進(jìn)行分析，采用外標(biāo)法以峰面積計算天麻素、腺苷、對羥基苯甲醇和對羥基苯甲醛的含量，結(jié)果見表2。

表2 云南昭通三個不同種天麻藥材中天麻素、腺苷、對羥基苯甲醇 和對羥基苯甲醛的質(zhì)量分?jǐn)?shù)(n=3，μg·g-1)

3 討論

一般認(rèn)為天麻素是天麻主要的活性成分，國家藥典中天麻質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定也主要以天麻素的含量作為重要的參考指標(biāo)，但多項(xiàng)有關(guān)天麻素的藥理研究報道，天麻素并沒有表現(xiàn)出與藥效相關(guān)的藥理活性。目前與天麻活性有關(guān)的成分研究主要以天麻素、腺苷、對羥基苯甲醇和對羥基苯甲醛為主。天麻原藥材中提取的天麻素及人工合成天麻素均無鎮(zhèn)靜安定作用[2]；并且臨床報道天麻可以明顯改善與腦供血不足有關(guān)的某些疾病的癥狀，而天麻素在實(shí)驗(yàn)中也未能表現(xiàn)出與天麻相似的增加血流量及抗缺氧的作用[3～4]。筆者前期研究結(jié)果顯示：天麻提取物及酚類成分對腦缺血損傷具有明顯的保護(hù)作用[5～8].其中的活性成分對羥基苯甲醇可通過減輕神經(jīng)細(xì)胞損傷對腦缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用[9～10]；對羥基苯甲醛在體內(nèi)、體外均有抗血小板聚集活性，且其作用具有選擇性對抗ADP途徑的血小板聚集[11]；腺苷能穿過血腦屏障發(fā)揮睡眠調(diào)節(jié)作用[12～16]。

多年的藥理研究表明中藥發(fā)揮其藥效作用往往是由多個成分，及其協(xié)同而發(fā)揮作用作用的，因此以藥材中含有的單一成分作為質(zhì)量控制指標(biāo)的方法可能不能全面的評價其質(zhì)量[17]。目前關(guān)于天麻藥材質(zhì)量控制方法《中國藥典》2010年版(一部)僅以天麻素作為質(zhì)量控制指標(biāo)，但本研究以天麻的主要活性成分天麻素、腺苷、對羥基苯甲醇和對羥基苯甲醛為研究對象，建立了對4個成分同時測定的HPLC方法，并對烏、綠、黃三種昭通天麻變型進(jìn)行了含量分析和比較，結(jié)果顯示：烏、綠、黃天麻中四個成分的含量有明顯差異，天麻素和對羥基苯甲醛的含量以黃天麻最高，腺苷和對羥基苯甲醇的含量以綠天麻最高。

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