張 霞，張書泰，謝順昌，杜希萍，2，3，李利君，2，3*

(1.集美大學生物工程學院，福建 廈門 361021;2.福建省食品微生物與酶工程重點實驗室，福建 廈門 361021;3.福建省高校食品微生物與酶工程技術研究中心，福建 廈門 361021)

甲基對硫磷(簡稱PM)又稱甲基1605，是一類目前廣泛使用的高效、高毒的有機磷農(nóng)藥，其主要中間代謝產(chǎn)物為對硝基苯酚(ρ-nitrophenol，PNP)，易溶于水，具有中等毒性。在PM降解成PNP過程中，農(nóng)藥的毒性降低了幾十甚至上百倍。但是，由于二者都具有苯環(huán)結(jié)構(gòu)，殘留期很長，給環(huán)境和人類健康帶來潛在的威脅［1-3］。因此，研究有機磷農(nóng)藥的降解具有廣泛的應用前景和應用價值。

目前，有機磷的降解途徑主要有光催化降解、化學降解和微生物降解。光催化降解和化學降解會造成二次污染且作用效果慢，而微生物能將農(nóng)藥從大分子化合物降解為小分子化合物，最終成為H2O和CO2，實現(xiàn)對環(huán)境的無害化降解［4］。在20世紀40年代后已經(jīng)成為研究的熱點，已發(fā)現(xiàn)能降解甲基對硫磷的微生物有:鄰單胞菌屬、假單胞菌屬、黃桿菌屬、節(jié)桿菌屬、沙雷氏菌屬、芽孢桿菌屬、木霉屬等［5］。這些分離得到的菌株大部分為細菌，而在真菌對該農(nóng)藥的降解方面研究相對較少。李樹彬［6］、劉玉煥［7］等研究認為真菌對農(nóng)藥的降解具有非常重要的作用。目前廣泛研究的生物反應器大多采用細菌作為微生物主體處理污染物。由于細菌需要在較濕潤、中性pH的環(huán)境下生長，對于水溶性好的有機物去除率較高，但對于水溶性差和酸性氣體或有酸性物質(zhì)積累的環(huán)境下，就很難達到處理效果。真菌形態(tài)上多數(shù)是菌絲結(jié)構(gòu)，具有較強的穿透力和降解能力，對于干燥環(huán)境和強酸性環(huán)境具有較強的耐受能力。因此真菌在處理有機污染物方面具有很大的應用價值。

本實驗室從有機磷農(nóng)藥污染的土壤里采樣，以PM為磷源配制培養(yǎng)基，分離得到了一株真菌，實驗室編號為JMUPMD-1，本文利用rDNA ITS分子序列分析和表觀形態(tài)及生理生化鑒定方法進行鑒定，檢測其降解PM的特點，為以后相關研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

(1)從受有機磷農(nóng)藥污染的土壤采集樣品，稱取10 g土樣接入100 mL選擇培養(yǎng)基中，在30℃、180 r/min的搖床上培養(yǎng)7 d，以10%接種量轉(zhuǎn)接到新鮮選擇培養(yǎng)基中，培養(yǎng)7 d后，再次以10%接種量接種于新鮮選擇培養(yǎng)基中，30℃、180 r/min的搖床上培養(yǎng)。

(2)取第3次富集所得培養(yǎng)液1 mL，將適合濃度的稀釋液0.1 mL涂布于選擇性固體培養(yǎng)基上，在30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4-8 d。

(3)挑取選擇平板上的單菌落進行平板劃線分離，純化并保種。

1.1.2 主要試劑 50%甲基對硫磷乳油購買于福建建甌福農(nóng)化工有限公司，40%樂果乳油購買于山東嘉誠農(nóng)藥化工有限公司，80%敵敵畏乳油購買于福建三農(nóng)集團股份有限公司，甲基對硫磷標準品濃度100 μg/mL，購自農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護科研檢測所。乙酸乙酯(色譜純)，購自美國TEDIA公司，酵母基因組DNA提取試劑盒(離心柱型)，購自TIANGEN公司，DNA 凝膠回收試劑盒 DW02-2、dNTPs、Taq酶、10×PCR Buffer均購自廣州東盛生物科技有限公司。ITS1、ITS4 通用引物濃度 25 μmol/L，由上海鼎安生物科技有限公司合成。其它實驗試劑均購自國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 方法

1.2.1 ITS序列的PCR擴增、測定和系統(tǒng)發(fā)育分析 將JMUPMD-1菌株分別在PDA平板和麥芽汁平板上劃線接種，收集對數(shù)生長期菌體，按照酵母基因組DNA提取試劑盒說明書所述步驟提取JMUPMD-1菌株總DNA，并以此為模板用ITS的通用引物 ITS1:5'-TCC GTA GGT GAA CCT GCG G-3'和ITS4:5'-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3'對其進行擴增［8］。PCR 擴增體系:超純水 16.2 μL、10 × PCR buffer 2.0 μL、dNTPs(2.5 mmol/L)1.0 μL、ITS1(25 μmol/L)0.2 μL、ITS4(25 μmol/L)0.2 μL、DNA模板 0.2 μL、Taq 酶(2.5 U/μL)0.2 μL。PCR 條件:96℃預變性5 min;94℃變性1 min，63℃退火1 min，72℃延伸1 min，30個循環(huán);72℃后延伸10 min?；厥誔CR產(chǎn)物由英駿生物公司測序，將測序結(jié)果在GenBank上進行同源比對。BLAST搜索GenBank數(shù)據(jù)庫中與該序列相似性較高的典型菌株的序列，ClustalX多序列比對，用 MEGA4.1中的 Neighbor-Joining(NJ)和Maximum Parsimony(MP)方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，用Bootstrap對系統(tǒng)樹進行統(tǒng)計檢驗。

1.2.2 JMUPMD-1菌株的生理生化特性

(1)葡萄糖發(fā)酵［9］將含有指示劑的葡萄糖發(fā)酵培養(yǎng)基分裝于試管中，裝液量10 mL，每管內(nèi)放一倒置的德漢氏小管，使其充滿培養(yǎng)基，112℃滅菌30 min。接種JMUPMD-1菌株，不接菌為空白對照，不加糖接種為陰性對照，并以釀酒酵母作為陽性對照，28℃靜置培養(yǎng)培養(yǎng)48 h后開始觀察，觀察1周。如果培養(yǎng)基顏色變黃且有氣泡產(chǎn)生，為發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，為發(fā)酵型;否則為不發(fā)酵葡萄糖型。

(2)碳源同化實驗［9］預先配制好YNB液體培養(yǎng)基，以0.5%比例分別加入赤蘚糖醇，半乳糖醇，乳糖，蜜二糖，0.22 μm 濾膜過濾除菌。分別接種JMUPMD-1菌株，以添加葡萄糖不接種作為空白對照，28℃190 rpm搖床培養(yǎng)7 d，試管中培養(yǎng)液變混濁記為陽性，否則記為陰性。結(jié)果觀察標準:將已培養(yǎng)數(shù)天的試管振蕩均勻。在一張白色卡片上畫上一條約3/4 mm寬的線，將卡片緊靠試管，對著自然光觀察，如果試管中溶液的混濁度將線掩蓋或變模糊，記此結(jié)果為+;如果溶液非常澄清，則記為－，表示未有酵母生長，即不能利用該碳源。

(3)尿素水解實驗［10］按培養(yǎng)基配方配制不含尿素的培養(yǎng)基100 mL，121℃滅菌25 min，待培養(yǎng)基冷卻至50℃左右，將預先過濾除菌的0.5 g/L的尿素水溶液4 mL添加到培養(yǎng)基中，混勻后分裝到無菌試管中，放置斜面。接種JMUPMD-1菌株，不接菌為空白對照，接種釀酒酵母做陰性對照。28℃培養(yǎng)觀察7 d。如果培養(yǎng)基顏色變紅，說明菌株產(chǎn)生脲酶，分解尿素產(chǎn)氨變堿，記為陽性;否則為陰性。

(4)50%葡萄糖(w/w)生長實驗［9］配制YPD培養(yǎng)基20 mL，加入0.4 g的瓊脂粉，稱量培養(yǎng)基的重量，加入等重的葡萄糖，加熱溶化后分裝入4根試管中，112℃滅菌30 min，放置斜面。接種JMUPMD-1菌株，不接菌為空白對照，28℃恒溫培養(yǎng)10 d。若能生長則說明該菌能耐受高濃度的葡萄糖，不生長則不能。

(5)硝酸鹽生長實驗［9］配制 YCB培養(yǎng)基100 mL，其中40 mL添加1%KNO3，30 mL加 1%硫酸銨作為陽性對照，剩余30 mL不加任何氮源作為陰性對照，0.22 μm濾膜過濾除菌，分裝于無菌大試管中，每管約10 mL，接種菌株JMUPMD-1，并做空白對照。28℃搖床培養(yǎng)7 d，根據(jù)培養(yǎng)液的渾濁度分析判斷。

1.2.3 形態(tài)鑒定 菌株JMUPMD-1接種于MEA平板上，于28℃恒溫培養(yǎng)。7 d后對菌落形態(tài)和顯微形態(tài)進行觀察。

1.2.4 甲基對硫磷的檢測 氣相色譜檢測條件:VARIAN CP-3800氣相色譜儀;色譜柱:HP-50毛細管柱，30 m × 530 μm × 1 μm;色譜柱 溫度:100 ℃(3 min)240℃(15 min);TSD檢測器溫度:300℃;進樣口溫度:240℃;載氣:99.999%高純氮氣，流速30 mL/min;氫氣5 mL/min;空氣175 mL/min;進樣量 1 μL，分流比 30∶1。

分析測定方法:稀釋適當倍數(shù)后，取2 mL培養(yǎng)液，添加1 g NaCl充分渦旋、鹽析;加入等體積乙酸乙酯提取，充分振蕩，靜置30 min，分離乙酸乙酯相;無水Na2SO4脫水，N2吹干;加1 mL乙酸乙酯搖勻，氣相色譜檢測(圖1)。

圖1 JMUPMD-1菌株對甲基對硫磷降解的氣相色譜圖Fig.1 Degradation to parathion-methyl in the presence of JMUPMD-1 determined by Gas Chromatography(GC)

1.2.5 JMUPMD-1菌株對環(huán)境中甲基對硫磷降解的模擬試驗 將JMUPMD-1菌株分別接種于選擇性液體培養(yǎng)基中，添加0.1%甲基對硫磷乳油為唯一磷源(培養(yǎng)液初始濃度約為350 μg/L)，以不接菌為對照組，在30℃下190 r/min培養(yǎng)7 d后，測定甲基對硫磷的濃度，計算JMUPMD-1菌株對甲基對硫磷的降解率。

1.2.6 JMUPMD-1菌株甲基對硫磷降解酶液的制備及活性測定 分別制備三株菌的發(fā)酵上清液及胞內(nèi)提取液，加入適量的甲基對硫磷進行反應，測定反應后甲基對硫濃度變化。

胞外提取液:菌株液體培養(yǎng)至6 d時，取50 mL發(fā)酵液8000 r/min離心，上清即為胞外提取液。

胞內(nèi)提取液:收集上步離心后的菌體，用蒸餾水洗滌菌體3次，將菌體置入研磨內(nèi)，加入適量的石英砂，放入冰箱中預冷，然后充分研磨。反復預冷研磨3次后加入10 mL 50 mmol/L的pH6.8磷酸鹽緩沖液，全部轉(zhuǎn)移至離心管中，0-4℃條件下浸泡24 h，8000 r/min離心得上清，即為胞內(nèi)提取液。

反應體系:30 μL濃度約為800 mg/L甲基對硫磷乳液，1950 μL 提取液(對照組為1950 μL 磷酸鹽緩沖液)，35 ℃下反應 40 min，20 μL 6 mol/L HCl終止反應。依據(jù)1.2.3的分析測定方法測定各反應體系中甲基對硫磷的濃度，并計算對照組和提取液處理組40 min后甲基對硫磷的濃度減少量。運用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計分析，確定各組中甲基對硫磷降解的顯著性。

2 結(jié)果

2.1 JMUPMD-1菌株rDNA ITS區(qū)域的序列分析及系統(tǒng)發(fā)育樹

提取JMUPMD-1的DNA為模板，用酵母ITS區(qū)域通用引物ITS1和ITS4為引物，進行PCR擴增反應并對相應PCR產(chǎn)物進行測序，共447個堿基，將序列提交到GenBank獲得登記注冊號為HM564395。利用BLAST軟件將所得基因序列與GenBank數(shù)據(jù)庫的序列進行同源性分析，結(jié)果顯示菌株JMUPMD-1與Candida blankii的同源性最高，達99%。收集與JMUPMD-1同源性較高的菌株序列，采用ClustslX進行多序列匹配比對，通過MEGA4.1軟件構(gòu)建系統(tǒng)進化樹(圖2)，結(jié)果表明 JMUPMD-1菌株同 Candida blankii WM 0719(FM178304)和Candida blankii MUCL29808(EU343873)系統(tǒng)發(fā)育關系最為密切，位于同一個分支。

圖2 菌株JMUPMD-1 ITS序列系統(tǒng)發(fā)育分析Fig.2 Phylogenetic tree derived from ITS sequences of strain JMUPMD-1

2.2 JMUPMD-1的生理生化特性

對JMUPMD-1菌株進行系列生理生化實驗，JMUPMD-1發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)酸不產(chǎn)氣;赤蘚糖醇、半乳糖醇、乳糖和蜜二糖的同化實驗表明JMUPMD-1可以同化赤蘚糖醇、半乳糖醇和乳糖，不能同化蜜二糖;尿素水解實驗顯示該菌株不能產(chǎn)生尿酶，所以不能分解尿素使指示劑變色;JMUPMD-1菌株在50%的高濃度葡萄糖培養(yǎng)基中不能生長，呈陰性，說明高濃度葡萄糖對該菌株的生長有很強抑制作用;JMUPMD-1在YPD培養(yǎng)基上于37℃條件下生長良好;氮源同化實驗中，以硫酸銨為唯一氮源的培養(yǎng)液變渾濁，以硝酸鉀為唯一氮源的培養(yǎng)液未見渾濁，表明JMUPMD-1不能同化硝酸鉀作為生長氮源。JMUPMD-1生理生化實驗結(jié)果匯總后同《酵母菌的特征與鑒定手冊》中Candida blankii標準菌株比較(表2.4)，結(jié)果顯示JMUPMD-1的生理生化特性同Candida blankii標準菌株的特性基本相符，只有葡萄糖發(fā)酵實驗中，JMUPMD-1可以發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)酸，而Candida blankii標準菌株對葡萄糖發(fā)酵是可變的、不確定的(V)，因此我們也認為是相符的。

表1 JMUPMD-1生理生化特性Tab.1 Biochemical characteristics of JMUPMD-1

2.3 JMUPMD-1 的形態(tài)觀察

菌株JMUPMD-1在MEA平板28℃培養(yǎng)7 d后，菌落呈白色，表面光滑，中心隆起，致密不透明，邊緣整齊、羽毛狀，推測是假菌絲的的宏觀表現(xiàn)。正反面顏色一致，菌落直徑 為 0.6 cm(圖 3A)。取JMUPMD-1培養(yǎng)液進行制片觀察，該菌單細胞為圓形，直徑 2.4-2.8 μm，有頂端出芽和三端出芽的繁殖方式(圖3B);取菌落邊緣制片觀察，發(fā)現(xiàn)該菌株具有假菌絲，寬約 2.75 μm，假菌絲上產(chǎn)生厚垣孢子(圖3C)。

圖3 JMUPMD-1的培養(yǎng)性狀及顯微特征Fig.3 Cultural and microscopic characteristics of strain JMUPMD-1

2.4 JMUPMD-1菌株降解甲基對硫磷能力和菌株提取液酶活測定

對JMUPMD-1菌株降解甲基對硫磷能力測定，甲基對硫磷由初始濃度350 μg/L降低至102.5 μg/L，降解率為 48.6% 。

對JMUPMD-1菌株的胞內(nèi)提取物和胞外提取物對甲基對硫磷的降解酶活性測定，經(jīng)胞內(nèi)提取物處理40 min后，甲基對硫磷含量減少了3.3 mg/L，經(jīng)胞外提取液處理40 min的甲基對硫磷含量僅減少0.36 mg/L。因此可以確定JMUPMD-1菌株發(fā)酵液上清無甲基對硫磷降解酶活性，胞內(nèi)提取液具有甲基對硫磷降解酶活性。

3 討論

甲基對硫磷作為有機磷殺蟲劑，具觸殺和胃毒作用，能抑制害蟲神經(jīng)系統(tǒng)中膽堿酯酶的活力而使其致死，殺蟲譜廣，能防治水稻、棉花、果樹、茶葉、蔬菜等作物的多種害蟲，但其防治效果較低，使用時用量較大，因此治理甲基對硫磷的污染對于保證環(huán)境安全和人類健康都有重要的意義［11-15］。目前，對于甲基對硫磷的降解機理的研究已較為透徹，也有不少的相關報道。在相關的報道中，關于細菌對甲基對硫磷的降解研究報道較多，真菌對甲基對硫磷的降解研究報道較少。本實驗室從集美大學附近土壤里分離到一株能以PM為磷源的真菌JMUPMD-1，經(jīng)鑒定該菌為布朗克假絲酵母菌，該菌不僅能在以甲基對硫磷為磷源的培養(yǎng)基中降解甲基對硫磷，即使在含有容易利用的磷源條件下(如K2HPO4)也可以降解甲基對硫磷。在該菌株培養(yǎng)基上清液未檢測出甲基對硫磷降解酶的活性，其所表達的甲基對硫磷降解酶為胞內(nèi)酶。本實驗發(fā)現(xiàn)，以350 μg/L甲基對硫磷為唯一磷源和350 μg/L甲基對硫磷及1 g/L K2HPO4組成的混合磷源培養(yǎng)該菌株，該菌降解率達48.6%，既豐富了甲基對硫磷降解菌廣譜，同時也為構(gòu)建工程菌提高降解酶的表達量，從而提高對農(nóng)藥的降解力和生產(chǎn)有機磷農(nóng)藥降解酶制劑奠定基礎。

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