蔣永亮,尹小虎,沈亞芳,何曉芬,方劍喬

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低頻電針改善SNL模型大鼠早期神經(jīng)痛背根神經(jīng)節(jié)辣椒素受體的機制

蔣永亮,尹小虎,沈亞芳,何曉芬,方劍喬

(浙江中醫(yī)藥大學第三臨床醫(yī)學院,杭州 310053)

探討低頻電針干預早期神經(jīng)痛背根神經(jīng)節(jié)(dorsal root ganglion,DRG)辣椒素受體(Transient receptor potential vanilloid type 1,TRPV1)的機制。將32只大鼠隨機分為正常組、假手術組、模型組與電針組,每組8只。采用脊神經(jīng)結扎的方法制作大鼠神經(jīng)痛模型。取患側足三里、昆侖穴進行2 Hz電針治療,連續(xù)3 d。檢測大鼠術側后足縮腿閾(Paw withdrawal threshold,PWT),L5DRG TRPV1表達與磷酸化水平。進一步開展PKC激動劑PMA與PKA激動劑db-cAMP拮抗2 Hz電針鎮(zhèn)痛作用的驗證性實驗。SNL模型大鼠早期即出現(xiàn)自發(fā)性疼痛,PWT顯著下降(＜0.001),L5DRG TRPV1表達水平降低(＜0.01),磷酸化水平升高(＜0.001)。SNL假手術組大鼠PWT沒有顯著變化。2 Hz電針能提高SNL模型大鼠的PWT(＜0.001),降低L5DRG TRPV1磷酸化水平(＜0.05)。PMA與db-cAMP足部局部注射能拮抗2 Hz電針的抗神經(jīng)痛作用(＜0.001,＜0.001)。早期神經(jīng)痛與損傷DRG TRPV1磷酸化水平升高有關。低頻電針能改善早期神經(jīng)痛,可能與下調損傷DRG的TRPV1磷酸化水平有關。

針刺療法;電針;神經(jīng)痛;脊神經(jīng)結扎;TRPV1;DRG;大鼠

神經(jīng)病理痛主要表現(xiàn)為痛覺敏化,如自發(fā)性疼痛、痛覺過敏與痛覺超敏[1],與初級痛覺神經(jīng)元的超興奮性有關[2]。多種離子通道在背根神經(jīng)節(jié)(dorsal root ganglion,DRG)神經(jīng)元中表達與功能的上調能引起初級痛覺神經(jīng)元的超興奮性,對神經(jīng)病理痛的發(fā)生起著重要作用。辣椒素受體(Transient receptor potential vanilloid type 1,TRPV1)是TRPs超家族(一類配體門控陽離子通道)中的一員,對疼痛信號的產生、傳遞與調節(jié)起著重要作用[3]。研究表明初級痛覺神經(jīng)元TRPV1活化能引起痛覺敏化[4-7],而其脫敏療法對多種神經(jīng)痛有效[8],說明初級痛覺神經(jīng)元TRPV1在神經(jīng)病理痛中起著重要作用。本實驗探討DRG神經(jīng)元TRPV1參與早期神經(jīng)痛的活化形式,以及低頻電針對其的干預作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

選用32只清潔級健康雄性SD大鼠,體重為(200±10)g,購自中國科學院上海實驗動物中心[SCXK(滬) 2008-0016],由浙江中醫(yī)藥大學實驗動物中心飼養(yǎng)。飼養(yǎng)期間給予嚙齒類動物標準顆粒飼養(yǎng)與自由飲水。

1.2 實驗儀器及試劑

0.25 mm×13 mm無菌針灸針(蘇州醫(yī)療用品廠有限公司);HANS-200A穴位神經(jīng)刺激儀(聯(lián)創(chuàng)科技南京濟生醫(yī)療科技有限公司);動態(tài)足底測量儀(意大利UGO Basile公司);凝膠成像儀(日本Fujifilm公司);蛋白酶抑制劑Cocktail(生工上海股份有限公司); RIPA裂解液(江蘇碧云天公司);BCA蛋白濃度測定試劑盒(碧云天公司);綿羊抗大鼠TRPV1多克隆抗體(美國Abcam公司);兔抗大鼠磷酸化TRPV1多克隆抗體(臺灣Abnova公司);小鼠單克隆抗體b-actin抗體(上?？党缮锕こ逃邢薰?;超敏ECL化學發(fā)光試劑盒(江蘇碧云天公司);PKA激動劑db-cAMP(美國Sigma公司);PKC激動劑PMA(美國Sigma公司)。

1.3 分組與造模

采用完全隨機法將大鼠隨機分為4組,分別為正常組、假手術組、模型組與低頻電針組,每組8只。按照前期右側L5脊神經(jīng)結扎(spinal nerve ligation, SNL)的方法建立神經(jīng)病理痛模型[9]。大鼠稱重后,用10% 水合氯醛3.5 mL/kg腹腔麻醉,大鼠呈俯臥位放置于手術臺上,腰部去毛,在脊柱右側旁開0.5 cm處沿L3-S2垂直切開皮膚,鈍性分離右側椎旁肌肉,小心咬除L5橫突,暴露、分離L5脊神經(jīng),用5/0絲線結扎,縫合切口,肌注青霉素預防感染。假手術組操作同模型組,但不結扎神經(jīng)。

1.4 電針治療

造模后1 d開始電針治療,選取術側足三里、昆侖穴(取穴參照華興邦大鼠穴位圖譜),連接韓氏穴位神經(jīng)刺激儀,刺激參數(shù)為2 Hz,1 mA、2 mA先后各15 min,連續(xù)治療3 d。正常組、模型組、假手術組大鼠不做治療,給予低頻電針組相同固定。

1.5 痛覺超敏反應檢測

采用動態(tài)足底測量儀檢測大鼠術側后足縮腿閾(Paw withdrawal threshold,PWT),評價大鼠機械痛覺超敏反應。測量前,將大鼠適應環(huán)境30 min。待大鼠安靜后,將連于機械泵上的類Von Frey絲的金屬絲(0.5 mm)置于大鼠右后足中央,避開足墊;啟動機械泵,金屬絲即以恒定速度自動上臺,對大鼠足底施加機械刺激。刺激力量從0 g開始以2.5 g/s遞增,直至大鼠產生縮腿反應;最大刺激力量為50 g,以免大鼠足爪受損;連續(xù)測量3次,取其平均值,每次間隔5 min。分別于造模前及造模后第1、2、3天測量PWT。

1.6 Western blotting檢測DRG TRPV1表達與p-TRPV1水平

造模后第3天將大鼠用10%水合氯醛腹腔注射(3.5 mL/kg)麻醉,剪開胸腔,暴露心臟。將灌注針頭從心尖直接刺入主動脈,剪開右心耳,進行生理鹽水灌注,迅速取出術側L4-6DRG,﹣80℃冰箱保存。采用RIPA裂解液結合超聲粉碎法抽提蛋白?？偟鞍咨蠘恿繛?0mg,電泳濃縮膠電壓為80 v,30 min,分離膠電壓為120 v,90 min;轉膜用0.45mm PVDF膜,90 min;在5%脫脂奶粉中封閉2 h;一抗孵育分別用綿羊抗大鼠TRPV1多克隆抗體(1:2000)、兔抗大鼠p-TRPV1單克隆抗體(1:1000)、小鼠抗大鼠b-actin單克隆抗體(1:10,000),在4℃孵育過夜。TBST緩沖液洗滌后,辣根過氧化物酶(HRP)結合二抗孵育2 h;用ECL試劑盒進行顯色反應,用凝膠成像儀攝像,用Image Quant TL軟件進行蛋白條帶灰度分析。

1.7 激動劑驗證實驗

將大鼠隨機分為生理鹽水注射對照組(EA＋Saline)、PKC激動劑PMA注射組(EA＋PMA)與PKA激動劑db-cAMP注射組(EA＋db－cAMP),每組8只。造模、電針治療同上。在造模后第3天于電針治療前10 min分別足背注射生理鹽水、100mg db-cAMP、1mg PMA。db-cAMP、PMA參照說明書先分別用純水、二甲基亞砜微量溶解,再用saline補足到50mL進行注射。分別于造模前及造模后第1、3天測量PWT。

1.8 統(tǒng)計學方法

分析采用SPSS16.0,實驗數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準誤表達,多組間比較采用單因素方差分析(-),組間兩兩比較采用檢驗。以＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 2 Hz電針對SNL模型大鼠早期術側PWT的影響

表1 各組大鼠不同時間點術側PWT比較 (±s,g)

注:與正常組比較1)＜0.01;與模型組比較2)＜0.01

與正常組比較,SNL模型組大鼠早期出現(xiàn)舔足、抬足等自發(fā)性疼痛現(xiàn)象,術側PWT顯著降低(＜0.001), SNL假手術組沒有顯著變化;電針組大鼠造模后PWT與正常組比較,差異具有統(tǒng)計學意義(＜0.01);電針組大鼠治療后PWT與模型組比較,差異具有統(tǒng)計學意義(＜0.001)。詳見表1。

2.2 2 Hz電針對SNL模型大鼠早期術側L5 DRG TRPV1表達的影響

與正常組比較,SNL模型組大鼠第3天術側L5DRG TRPV1表達顯著降低(＜0.01);2 Hz電針對SNL大鼠術側L5 DRG TRPV1表達沒有顯著影響(＞0.05)。詳見圖1。

注:與正常組比較1)P＜0.01

2.3 2 Hz電針對SNL模型大鼠早期術側L5 DRG TRPV1磷酸化水平的影響

與正常組比較,SNL模型組大鼠第3天術側L5DRG p-TRPV1水平顯著升高(＜0.001);2 Hz電針能顯著降低SNL大鼠術側L5 DRG升高的p-TRPV1水平(＜0.05)。詳見圖2。

注:與正常組比較***P＜0.01;與SNL組比較#P＜0.05

2.4 PKC、PKA激動劑對2 Hz電針抗神經(jīng)痛作用的影響

PKC激動劑PMA、PKA激動劑db-cAMP能顯著拮抗2 Hz電針抗SNL神經(jīng)痛的作用(＜0.001,＜0.001)。詳見表2。

表2 PMA、db-cAMP對2 Hz電針抗神經(jīng)痛作用的影響 (±s,g)

注:與生理鹽水注射對照組比較1)＜0.01

3 討論

本實驗結果表明,在神經(jīng)痛早期損傷DRG TRPV1通過磷酸化形式活化,而非通過表達增強。2 Hz低頻電針能有效干預TRPV1磷酸化水平發(fā)揮對早期神經(jīng)痛的治療作用。

TRPV1在外周主要分布在較細的DRG神經(jīng)元、C纖維和Ad纖維[8],參與疼痛信號的產生、傳遞與調節(jié)。研究表明DRG TRPV1激活能誘導大鼠三叉神經(jīng)痛[10],而對其的脫敏療法能有效減輕多種神經(jīng)痛[8],說明DRG TRPV1活化對神經(jīng)痛的發(fā)生起著重要作用。有報道, TRPV1功能上調參與炎癥痛痛敏化的發(fā)生,而其表達上調參與炎癥痛痛敏化的維持[11]。對于早期神經(jīng)痛DRG TRPV1通過何種途徑活化(功能上調還是表達上調)參與痛敏化過程尚未清楚。

本實驗結果顯示,SNL模型大鼠早期就出現(xiàn)舔足、抬足等自發(fā)性痛覺疼痛現(xiàn)象與機械性痛覺超敏反應,其損傷DRG的TRPV1磷酸化水平上升,而表達下降。神經(jīng)損傷或病變時,蛋白激酶PKC、cAMP依賴的PKA被激活,磷酸化TRPV1,使TRPV1功能上調,引起痛覺敏化[5-6]。損傷DRG TRPV1磷酸化水平升高引起的TRPV1功能上調可能在SNL神經(jīng)痛早期中起著重要作用。

低頻電針對神經(jīng)痛有顯著的鎮(zhèn)痛效應[12-13],且不被納洛酮阻斷[14],表明電針對神經(jīng)痛的干預存在非阿片機制。本實驗結果也證實2 Hz低頻電針能有效減輕SNL模型大鼠早期的機械性痛覺超敏。筆者之前的研究表明2 Hz低頻電針也能減輕SNL模型大鼠維持期(SNL造模后第15天)的機械性痛覺超敏[9]。其他研究也表明低頻電針對糖尿病外周神經(jīng)痛、神經(jīng)營養(yǎng)因子注射誘導的神經(jīng)痛以及癌性痛均有鎮(zhèn)痛作用[15-17]。這些表明低頻電針對神經(jīng)痛有明確的治療作用。2 Hz低頻電針能降低SNL模型大鼠早期神經(jīng)痛損傷DRG的TRPV1磷酸化水平,考慮到神經(jīng)損傷或病變時,蛋白激酶PKC、PKA被激活,能通過磷酸化TRPV1增強初級痛覺神經(jīng)元的興奮性,進而導致痛覺敏化[5-6],筆者進一步采用PKC激動劑PMA與PKA激動劑db-cAMP足部局部注射觀察對2 Hz低頻電針鎮(zhèn)痛作用的影響。筆者發(fā)現(xiàn)PMA、db-cAMP能拮抗2 Hz低頻電針抗SNL早期神經(jīng)痛的作用。這些說明,在神經(jīng)痛早期,2 Hz低頻電針改善痛覺敏化可能與下調DRG TRPV1磷酸化水平有關。筆者之前的研究表明,在神經(jīng)痛的維持期,2 Hz低頻電針對TRPV1也有一定的調節(jié)作用,能下調鄰近未損傷DRG的TRPV1表達水平。

綜上所述,本實驗研究結果表明,SNL神經(jīng)痛早期痛覺敏化與DRG TRPV1磷酸化水平升高有關。低頻電針能改善早期神經(jīng)痛,可能與下調損傷DRG的TRPV1磷酸化水平有關。電針療法在神經(jīng)痛的治療上具有廣闊的應用前景。

[1] Wang W, Gu J, Li YQ,. Are voltage-gated sodium channels on the dorsal root ganglion involved in the development of neuropathic pain?[J]. Mol Pain, 2011,7:16.

[2] Baron R. Mechanisms of disease: neuropathic pain--a clinical perspe- ctive[J]. Nat Clin Pract Neurol, 2006,2(2):95-106.

[3] Palazzo E, Luongo L, de Novellis V,. Moving towards supras- pinal TRPV1 receptors for chronic pain relief[J]. Mol Pain, 2010,6:66.

[4] Bolay H and Moskowitz MA. Mechanisms of pain modulation in chronic syndromes[J]. Neurology, 2002,59(5 Suppl 2):S2-7.

[5] Jara-Oseguera A, Simon SA, Rosenbaum T. TRPV1: on the road to pain relief[J]. Curr Mol Pharmacol, 2008,1(3):255-269.

[6] Rathee PK1, Distler C, Obreja O,. PKA/AKAP/VR-1 module: A common link of Gs-mediated signaling to thermal hyperalgesia[J]. J Neurosci, 2002,22(11):4740-4745.

[7] Bhave G, Hu HJ, Glauner KS,. Protein kinase C phosphorylation sensitizes but does not activate the capsaicin receptor transient receptor potential vanilloid 1 (TRPV1) [J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2003,100(21):12480-12485.

[8] Xia R, Dekermendjian K, Lullau E,. TRPV1: A Therapy Target That Attracts the Pharmaceutical Interests[J]. Adv Exp Med Biol, 2011,704:637-665.

[9] Jiang YL, Yin XH, Shen YF,. Low Frequency Electroacupunc- ture Alleviated Spinal Nerve Ligation Induced Mechanical Allodynia by Inhibiting TRPV1 Upregulation in Ipsilateral Undamaged Dorsal Root Ganglia in Rats[J]. Evid Based Complement Alternat Med, 2013, 2013:170910.

[10] Loyd DR, Weiss G, Henry MA,. Serotonin increases the functional activity of capsaicin-sensitive rat trigeminal nociceptors via peripheral serotonin receptors[J]. Pain, 2011,152(10):2267-2276.

[11] Zhu H, Yang Y, Zhang H,. Interaction between protein kinase D1 and transient receptor potential V1 in primary sensory neurons is involved in heat hypersensitivity[J]. Pain, 2008,137(3):574-588.

[12] 王賀春,萬有,王韻,等.不同穴位電針治療大鼠慢性神經(jīng)源性痛的療效比較[J].針刺研究,2002,27(3):180-185.

[13] 馬騁,李翠賢,余黎.電針對大鼠神經(jīng)病理痛SNI模型脊髓背角傳入神經(jīng)末梢Glu的影響[J].南京中醫(yī)藥大學學報,2010,26(5): 379-382,411.

[14] 孫瑞卿,王賀春,景崢,等.2 Hz電針減輕神經(jīng)源性痛大鼠的痛覺超敏和冷誘發(fā)的持續(xù)性疼痛[J].中國疼痛醫(yī)學雜志,2003,9(4): 220-224.

[15] Manni L, Florenzano F, Aloe L. Electroacupuncture counteracts the development of thermal hyperalgesia and the alteration of nerve growth factor and sensory neuromodulators induced by streptozotocin in adult rats[J]. Diabetologia, 2011,54(7):1900- 1908.

[16] Aloe L, Manni L. Low-frequency electro-acupuncture reduces the nociceptive response and the pain mediator enhancement induced by nerve growth factor[J]. Neurosci Lett, 2009,449(3):173-177.

[17] Zhang Z, Wang C, Gu G,. The effects of electroacupuncture at the ST36 (Zusanli) acupoint on cancer pain and transient receptor potential vanilloid subfamily 1 expression in Walker 256 tumor- bearing rats[J]. Anesth Analg, 2012,114(4):879-885.

Dorsal Root Ganglion Capsaicin Receptor-involved Mechanism of Low-frequency Electroacupuncture in Alleviating Early Neuropathic Pain in a Rat Model of SNL

-,-,-,-,-.

,310053,

To investigate the dorsal root ganglion (DRG) capsaicin receptor (transient receptor potential vanilloid type 1, TRPV1)-involved mechanism of low-frequency electroacupuncture in alleviating early neuropathic pain.Thirty-two rats were randomly allocated to normal, sham operation, model and electroacupuncture groups, 8 rats each. A rat model of neuropathic pain was made by spinal nerve ligation. Points Zusanli and Kunlun on the affected side were selected for three consecutive days of treatment with 2 Hz electroacupuncture. Operated side hind paw withdrawal threshold (PWT), and L5DRG TRPV1 expression and phosphorylation levels were measured in the rats. The antagonistic effects of PKC agonist PMA and PKA agonist db-cAMP on 2 Hz electroacupuncture analgesia were further validated.Spontaneous pain occurred in the early stage, and PWT lowered markedly (＜0.001), L5DRG TRPV1 expression levels fell (＜0.01) and L5DRG TRPV1 phosphorylation levels rose (＜0.001) in a rat model of SNL. PWT did not change in the sham SNL group of rats. 2 Hz electroacupuncture raised PWT (＜0.001) and lowered L5DRG TRPV1 phosphorylation levels (＜0.05) in a rat model of SNL. Local injection of the foot with PMA and db-cAMP inhibited the alleviating effect of 2 Hz electroacupuncture on neuropathic pain (＜0.001,＜0.001).Early neuropathic pain is related to a rise in TRPV1 phosphorylation levels in the injured DRG. Low-frequency electroacupuncture can relieve early neuropathic pain, which may be related to the down-regulation of TRPV1 phosphorylation levels in the injured DRG.

Acupuncture therapy; Electroacupuncture; Neuropathic pain; Spinal nerve ligation; TRPV1; DRG; Rats

1005-0957(2014)05-0476-04

R2-03

A

10.13460/j.issn.1005-0957.2014.05.0476

2014-01-07

國家自然科學基金資助項目(81072855,81303039);浙江省自然科學基金資助項目(LY12H27015,Z2100979);國家中醫(yī)藥管理局重點學科(針灸學)

蔣永亮(1981 - ),男,助理研究員

方劍喬(1961 - ),男,教授,Email:fangjianqiao7532@163. com