丁齊，邢曉東，李麗霞

（南京理工大學(xué)化工學(xué)院，江蘇 南京 210094）

聚N-異丙基丙烯酰胺（PNIPAM）水凝膠是一種典型的溫敏水凝膠，當(dāng)外界溫度低于最低臨界溶解溫度（LCST）時(shí)，親水基團(tuán)通過(guò)氫鍵與水分子結(jié)合，凝膠吸水溶脹。溫度高于LCST時(shí)，氫鍵作用減弱，疏水基團(tuán)間的相互作用加強(qiáng)，凝膠失水收縮[1]。以PNIPAM溫敏型水凝膠固載酶，可以利用其可逆的相轉(zhuǎn)變過(guò)程，在其LCST附近升降溫度，凝膠收縮溶脹吸入或吐出底物使反應(yīng)進(jìn)行或中斷，起到一個(gè)“開(kāi)關(guān)”的作用，而且溫度高時(shí)凝膠收縮疏水，有利于保護(hù)酶不會(huì)高溫下失活；同樣的原理，還可以利用溫敏凝膠的這種特性來(lái)固定化酶，溫度低時(shí)，凝膠溶脹將酶溶液吸入內(nèi)部，進(jìn)行固定化反應(yīng)，溫度高時(shí)，凝膠收縮將沒(méi)有反應(yīng)的溶液排出。半互穿聚合物網(wǎng)絡(luò)（semi-IPN）技術(shù)可以改善水凝膠的性能，在 semi-IPN水凝膠中兩種組分間沒(méi)有化學(xué)結(jié)合，各組分具有相對(duì)獨(dú)立性，這種結(jié)構(gòu)可以提高每個(gè)分子鏈的相容性，增加網(wǎng)絡(luò)密度，增大相互間結(jié)合力[2]。Alves等[3]以N-異丙基丙烯酰胺、海藻酸鈣制備了 pH/溫度敏感的半互穿水凝膠，并分別研究了其pH值、溫度響應(yīng)性。Guo等[4]以羧甲基殼聚糖和聚（N-異丙基丙烯酰胺）制備了半互穿網(wǎng)絡(luò)的水凝膠聚合物，并研究了該聚合物的藥物釋放性能。

巰基是蛋白質(zhì)氨基酸殘基中最活潑的反應(yīng)性基團(tuán)[5]，其與馬來(lái)酰亞胺的邁克爾加成反應(yīng)是經(jīng)典的點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)。該反應(yīng)在三乙胺催化下具有反應(yīng)選擇性、活性高及反應(yīng)條件溫和的特點(diǎn)[6-7]。已有的文獻(xiàn)，大多是以戊二醛為交聯(lián)劑進(jìn)行酶的固定化的，很少有研究者利用點(diǎn)擊反應(yīng)進(jìn)行酶的固定化研究。本工作以甲基丙烯酸-β-羥乙酯（HEMA）和N-異丙基丙烯酰胺（NIPAM）為原料制備了溫敏型的多孔半互穿水凝膠，然后引入馬來(lái)酰亞胺基團(tuán)修飾，得到新型固定化酶載體：水凝膠Ⅰ和Ⅱ，研究了其溶脹性能，然后利用馬來(lái)酰亞胺與巰基的點(diǎn)擊反應(yīng)進(jìn)行酶的固定化[8]，并全面考察了固定化酶的性能。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

N-異丙基丙烯酰胺（NIPAM）（≥98%），偶氮二異丁腈（AIBN）（99%），順丁烯二酸酐（馬來(lái)酸酐，AR，99.5%），阿拉丁試劑有限公司；N,N-亞甲基雙丙烯酰胺（BIS，≥98%），天津市化學(xué)試劑研究所，乙醇重結(jié)晶；聚乙二醇2000（PEG2000，CP），西隴化工有限公司；2-hydroxyethyl methacrylate（HEMA，97%），ACROS ORGANICS；脂肪酶、糖化酶，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

JSM-6380LV型掃描電鏡，日本 JEOL公司；Nicolet iS10型傅里葉變換紅外光譜儀，美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司。

1.2 水凝膠酶固定化載體的制備及表征

1.2.1 水凝膠及凝膠固定化載體的制備

（1）線型聚合物 PHEMA和PAEMA 的制備

PHEMA：將5 mg引發(fā)劑AIBN以及單體HEMA 0.9 g溶于4 mL DMSO中，通氮?dú)猓?0 ℃反應(yīng)10 h。PAEMA： PHEMA 加入適量乙二胺，117 ℃回流10 h，除去未反應(yīng)的乙二胺，得到產(chǎn)物。反應(yīng)式如式（1）。

（2）多孔半互穿水凝膠的制備

制孔劑PEG2000 100 mg、單體NIPAM 150 mg、交聯(lián)劑Bis 4 mg、引發(fā)劑AIBN 3 mg以及PHEMA或PAEMA 75 mg于DMSO 0.6 mL中溶解，通氮?dú)猓?0 ℃反應(yīng)6 h，得到半互穿凝膠C或B，將凝膠于蒸餾水中浸泡14天（每天換水）。水凝膠C于乙二胺中117 ℃回流10 h，反應(yīng)結(jié)束后沸水洗滌，得到水凝膠A。反應(yīng)式如式（2）、式（3）。

（3）水凝膠的馬來(lái)酰亞胺修飾

10 mL N，N-二甲基甲酰胺（DMF）為溶劑，分別加入水凝膠 A、B，通氮?dú)?，邊攪拌邊滴加馬來(lái)酸酐（0.5 g），滴加完畢后繼續(xù)攪拌1 h。然后加入5 mL三乙胺，153 ℃回流4 h，反應(yīng)結(jié)束后用水洗滌凝膠多次，分別得到水凝膠Ⅰ和Ⅱ。反應(yīng)式如式（4）。

1.2.2 水凝膠Ⅰ和Ⅱ的表征及性能測(cè)試

真空干燥好的水凝膠A、B、C、Ⅰ、Ⅱ研成粉末，采用衰減全反射（ATR）法測(cè)定其紅外光譜。

室溫下達(dá)到溶脹平衡的水凝膠Ⅰ和Ⅱ切片，快速冷凍后冷凍干燥48 h做掃描電鏡表征。多孔半互穿水凝膠具有多孔結(jié)構(gòu)，采用冷凍干燥可以保持水凝膠的結(jié)構(gòu)在干燥過(guò)程中不被破壞。

將水凝膠Ⅰ和Ⅱ在 20～50 ℃蒸餾水中浸泡，待其達(dá)到溶脹平衡，用潤(rùn)濕的濾紙拭干水凝膠表面的水分，稱重。水凝膠的溶脹比 SR定義為：SR=(ms?md)/md。式中 ms為達(dá)到某一溫度溶脹平衡狀態(tài)時(shí)的水凝膠的質(zhì)量；md為真空干燥至恒重時(shí)凝膠的質(zhì)量。

將室溫下達(dá)到溶脹平衡的水凝膠Ⅰ和Ⅱ快速轉(zhuǎn)移至 50 ℃的蒸餾水中，每隔一定時(shí)間取出水凝膠稱取水凝膠的質(zhì)量mt，直至其質(zhì)量不變?yōu)橹埂Ｋz保水率 WR 定義為：WR=(mt?md)/ mr×100% 。式中mr為室溫下達(dá)到溶脹平衡時(shí)水凝膠中水的質(zhì)量。作保水率與時(shí)間的關(guān)系曲線，即得水凝膠在 50 ℃的去溶脹動(dòng)力學(xué)曲線。

將真空干燥至恒重的水凝膠Ⅰ和Ⅱ浸泡在室溫下的蒸餾水中，每隔一定時(shí)間，取出水凝膠稱重，直至其質(zhì)量不變。凝膠吸水率 WU定義為：WU=(mt?md)/mr×100%。作吸水率與時(shí)間的關(guān)系曲線，即得水凝膠在室溫下的再溶脹動(dòng)力學(xué)曲線。

1.3 固定化酶的制備及性能測(cè)定

1.3.1 固定化酶的制備

根據(jù)Agnieszka等[9]提出的方法，利用多孔半互穿溫敏水凝膠的溫敏性能，高溫時(shí)凝膠收縮，將其加入到酶溶液中，凝膠開(kāi)始吸收酶溶液發(fā)生溶脹，酶分子在凝膠內(nèi)部與凝膠發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)，制得固定化酶。得到的固定化脂肪酶于0.1 mol/L的磷酸鹽緩沖液（pH值 7.0）4 ℃保存，固定化糖化酶于0.1mol/L的乙酸鹽緩沖液（pH值4.5）4 ℃保存，備用。反應(yīng)式如式（5）。

在本實(shí)驗(yàn)中，將采用以水凝膠A和B為載體，2.5%戊二醛溶液為交聯(lián)劑的固定化酶作為對(duì)比（本研究條件下，戊二醛濃度為2.5%時(shí)得到的固定化酶活性、穩(wěn)定性等相對(duì)最佳）。

1.3.2 固定化酶性能測(cè)定

酶的固載量測(cè)定采用 BCA蛋白試劑盒法。固載量=(c初?c余)v/m干凝膠，式中，c初為固定化之前初始酶液的蛋白濃度，mg/mL；c余為固定化后酶余液的蛋白濃度，mg/mL；v為固定酶時(shí)所用酶溶液的體積，mL；m干凝膠為干燥的凝膠載體的質(zhì)量，g。

在一定條件下，酶催化反應(yīng)進(jìn)行每分鐘釋放出1 μmol產(chǎn)物所需酶/固定化酶的量為一個(gè)活力單位（U）：U=cv/tm。式中，U為酶活力，U/g或U/mL；c為產(chǎn)物的濃度，μmol/mL；v為產(chǎn)物溶液的體積，mL；t為反應(yīng)時(shí)間，min；m為消耗的酶的質(zhì)量，g；糖化酶為體積，mL。脂肪酶的活力測(cè)定采用對(duì)硝基苯酚棕櫚酸酯（Pnpp）法；糖化酶的活力測(cè)定采用葡萄糖氧化酶法（GOD）法。

活力回收率=Us/U0×100%。其中，Us為固定化酶的活性，U/g或 U/mL；U0固定化之前游離酶的活性，U/g或U/mL。

連續(xù)進(jìn)行 10次催化反應(yīng)后固定化酶的活性與剛剛固定化之后酶的活性之比為固定化酶的操作穩(wěn)定性，設(shè)剛固定化完后固定化酶的活力為 100%；65 ℃下保存16 h后固定化酶的活性與剛固定化完后酶活力比值即為固定化酶的熱穩(wěn)定性；4 ℃下保存 20天后固定化酶活力與剛固定后固定化酶的活力比值即為固定化酶的貯存穩(wěn)定性。

2 結(jié)果與討論

2.1 溫敏型大孔半互穿水凝膠的表征與性能

2.1.1 紅外光譜分析

圖1 水凝膠紅外光譜圖

圖1是水凝膠A、B和C的紅外譜圖。

圖1中，3290～3430 cm?1為PNIPAM 中N—H以及PHEMA中O—H的伸縮振動(dòng)吸收峰；3078 cm－1為N—H 面內(nèi)彎曲振動(dòng)倍頻帶； 2874 cm－1、2931 cm－1、2966 cm－1處由甲基亞甲基以及聚合物主鏈上的C—H伸縮振動(dòng)產(chǎn)生；1650 cm－1由酰胺上羰基伸縮振動(dòng)產(chǎn)生，即酰胺Ⅰ帶，1538 cm－1由酰胺上N—H面內(nèi)彎曲振動(dòng)及C—N伸縮振動(dòng)的組合吸收產(chǎn)生的，即酰胺Ⅱ帶，在1385 cm?1、1365 cm?1處為異丙基上的雙甲基由于對(duì)稱變形振動(dòng)耦合分裂成的雙峰。不同的是：水凝膠C中，1725 cm?1處為PHEMA中酯的羰基伸縮振動(dòng)吸收峰；1135 cm－1，1080 cm?1處為C—C，C—O單鍵伸縮振動(dòng)吸收峰；1047 cm?1處是PHEMA中羥基的C—O伸縮振動(dòng)吸收峰。水凝膠 A 中，1725 cm?1處的吸收峰減弱，1047cm?1處的吸收峰消失，這都說(shuō)明了乙二胺與酯基發(fā)生反應(yīng)，乙二胺修飾成功。而水凝膠B中，1725 cm－1處吸收峰相對(duì)于凝膠 A減弱的更多一些，1047cm－1處的吸收峰也消失，說(shuō)明了該凝膠的制備成功，而且其α-NH2的含量比A凝膠多。

圖2 多孔半互穿水凝膠載體紅外光譜圖

圖2為馬來(lái)酰亞胺化水凝膠的紅外光譜圖，理論上 1775 cm?1、1711 cm－1和 1143 cm－1為酰亞胺基團(tuán)特征吸收峰，1604 cm－1為碳碳雙鍵特征吸收峰[10]。但是本實(shí)驗(yàn)紅外光譜圖中未觀察到明顯的特征吸收峰，原因可能是水凝膠的酰胺基紅外吸收峰較大，相對(duì)少量的馬來(lái)酰亞胺基團(tuán)特征峰被覆蓋，以至于觀察不到。

2.1.2 掃描電鏡

將凝膠制備成多孔結(jié)構(gòu)，有利于凝膠溶脹/退溶脹速率的增加，底物的進(jìn)出和酶的固定化。本研究以PEG2000為致孔劑制備多孔水凝膠，馬來(lái)酰亞胺基團(tuán)修飾后水凝膠載體Ⅰ和Ⅱ的掃描電鏡照片如圖3所示。

圖3 多孔半互穿水凝膠載體Ⅰ、Ⅱ掃描電鏡圖

從圖3可以看出兩種水凝膠載體均含有相互貫通的多孔結(jié)構(gòu)，孔洞大小及分布比較均勻。水凝膠Ⅰ孔徑較大，平均為30 μm左右；水凝膠Ⅱ的孔徑平均為10 μm，與水凝膠Ⅱ孔徑相比較小。大量的孔洞增加了水凝膠與外界的接觸面積。

2.1.3 水凝膠的溶脹率

溶脹率（SR）是評(píng)價(jià)水凝膠性質(zhì)的一個(gè)重要參數(shù)[11]。本工作研究了溫度對(duì)溶脹率的影響。

由圖4可知，20 ℃時(shí)水凝膠Ⅰ的SR可達(dá)到22，而水凝膠Ⅱ的SR僅為14。以交聯(lián)劑用量來(lái)表征交聯(lián)度[12]，兩種水凝膠 SR相對(duì)于其他文獻(xiàn)較小的原因是本文所制備的兩種水凝膠交聯(lián)劑用量為2.6%，為了保證水凝膠有一定的強(qiáng)度所以交聯(lián)度比較大，從而導(dǎo)致其溶脹比較小。水凝膠B的胺化程度高于A，從而導(dǎo)致Ⅱ的馬來(lái)?；潭纫采愿哂冖?，而親水性小于Ⅰ。隨著溫度升高， 兩種水凝膠開(kāi)始收縮脫水，SR越來(lái)越小。33 ℃以后，水凝膠Ⅰ的 SR下降的很快，37 ℃左右開(kāi)始趨于平衡狀態(tài)；水凝膠Ⅱ的SR下降的相對(duì)比較平穩(wěn)，也是在37 ℃左右開(kāi)始達(dá)到平衡狀態(tài)。從圖4中可以看出，兩種水凝膠的 LCST均在33～36 ℃之間，與聚（N-異丙基丙烯酰胺）溫敏凝膠的 LCST[13]相差不大，說(shuō)明半互穿結(jié)構(gòu)對(duì)水凝膠的溫敏性沒(méi)有產(chǎn)生影響。

2.1.4 水凝膠的去溶脹動(dòng)力學(xué)

圖4 水凝膠不同溫度平衡時(shí)的溶脹比曲線

如圖5所示，水凝膠Ⅰ在最初的10 min內(nèi)快速失去網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中約90%的水分，保水率快速下降，約20 min后達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)，此時(shí)失去約 93%的水；而水凝膠Ⅱ失水更快一些，在 10 min 內(nèi)失水約95%，約20 min開(kāi)始趨于穩(wěn)定狀態(tài)。當(dāng)水凝膠處在較高溫度（LCST以上）時(shí)開(kāi)始收縮，表面區(qū)域的相互作用首先被破壞，并迅速釋放結(jié)合的水分子。可以看出兩種水凝膠對(duì)溫度響應(yīng)均很敏感，在短時(shí)間內(nèi)能夠?qū)ν饨鐪囟鹊淖兓鞒鲚^快的響應(yīng)，這有利于固定化酶催化反應(yīng)的控制。可能是由于水凝膠Ⅱ含有的孔洞內(nèi)徑比Ⅰ小，孔洞的量比Ⅰ多，比表面積比較大，水分子能盡快的從凝膠網(wǎng)絡(luò)中排出來(lái)，所以水凝膠Ⅱ的溫度響應(yīng)速率比Ⅰ要稍快一些。

圖5 2種水凝膠50 ℃的去溶脹動(dòng)力學(xué)曲線

2.1.5 水凝膠的再溶脹動(dòng)力學(xué)

水凝膠的再溶脹動(dòng)力學(xué)曲線見(jiàn)圖 6。與去溶脹相比，水凝膠的再溶脹速率要慢得多。這是由于水凝膠去溶脹時(shí)，處于溶脹狀態(tài)，高分子鏈的自由度較大；而當(dāng)干凝膠進(jìn)行再溶脹時(shí)，高分子鏈間距離較小，疏水作用較強(qiáng)，水分子需要首先破壞這種疏水作用才能使凝膠吸水再溶脹，因而其再溶脹速率要慢得多[12]。水凝膠Ⅰ和Ⅱ在前50 min內(nèi)吸水量基本呈線性上升，吸水率大致相當(dāng)；從70 min開(kāi)始，兩種水凝膠吸水率有了變化，水凝膠Ⅰ的吸水率稍大于Ⅱ，并以這種趨勢(shì)平緩增長(zhǎng)，250 min時(shí)其吸水率達(dá)到92%，此后吸水率趨于穩(wěn)定。水凝膠Ⅱ的再溶脹曲線走勢(shì)與Ⅰ大致相同，在250 min時(shí)開(kāi)始趨于穩(wěn)定狀態(tài)，但此時(shí)水凝膠Ⅱ的吸水率約為88%，稍小于水凝膠Ⅰ。

2.2 水凝膠載體巰基固定化酶性能

圖6 水凝膠25 ℃的再溶脹動(dòng)力學(xué)曲線

表2為固定化酶的固載量、活性、活力回收率、穩(wěn)定性等性能參數(shù)。

由表2可知，凝膠Ⅱ固定化酶的固載量為25.50 mg/g，大于凝膠Ⅰ固定化酶的14.60 mg/g。分析可能原因是由于NIPAM/PAEMA水凝膠中α-NH2含量比較高，引入的馬來(lái)酰亞胺基團(tuán)也NIPAM/PHEMA凝膠要多，所以通過(guò)巰基與馬來(lái)酰亞胺反應(yīng)的酶的量也多，因此凝膠Ⅱ固定化酶的固載量相對(duì)來(lái)說(shuō)比較大。凝膠Ⅱ固定化酶活力為0.82 U/g，活力回收率可達(dá)到 6.03%，比較可觀，從穩(wěn)定性來(lái)看，其操作穩(wěn)定性可達(dá)到接近 90%，而熱穩(wěn)定性也可達(dá)到80%以上，儲(chǔ)存穩(wěn)定性達(dá)90%以上，回收重復(fù)利用的價(jià)值比較大；凝膠Ⅰ固定化酶的酶活力為0.59 U/g，活力回收率為4.32%，小于凝膠Ⅱ固定化酶，其操作穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性也不及凝膠Ⅱ固定化酶，但儲(chǔ)存穩(wěn)定性相近。綜合來(lái)看Ⅰ和Ⅱ固定化酶的活性以及各項(xiàng)穩(wěn)定性均比相應(yīng)的A和B要高，可能原因：戊二醛分子之間發(fā)生相互的交聯(lián)反應(yīng)，影響了固定化的效率；一個(gè)酶分子可能通過(guò)多點(diǎn)與戊二醛交聯(lián)，使得酶分子被禁錮在中間，活性大大降低；戊二醛還可以與酶分子上的其他活性官能團(tuán)發(fā)生反應(yīng)，從而降低酶的活性或使酶失活[14-15]。而馬來(lái)酰亞胺與巰基的點(diǎn)擊反應(yīng)選擇性高，不會(huì)與其他活性基團(tuán)發(fā)生反應(yīng)，而且其反應(yīng)條件比較溫和，不會(huì)影響酶的活性，所以得到的固定化酶活性比較大。

表2 固定化酶性能

糖化酶的固載量小于脂肪酶，但由于其游離酶本身活性比較大（需要稀釋一定倍數(shù)以便測(cè)定其活性），所以雖然糖化酶的固載量小，是其活性卻較大。與固定化脂肪酶相似，凝膠Ⅱ固定糖化酶的固載量為0.82 mg/g，約是凝膠Ⅰ固定化酶的2倍，其酶活力最大可達(dá)12.04 U/mL，此時(shí)活力回收率為3.40%，其操作穩(wěn)定性、熱穩(wěn)定性均在85%以上，具有很高的回收利用價(jià)值。凝膠Ⅰ固定化酶的酶活力為10.05 U/mL，活力回收率為2.84%，略小于凝膠Ⅱ固定化酶，但其操作穩(wěn)定性與其相當(dāng)，熱穩(wěn)定性也在70%以上，穩(wěn)定性也比較好。與脂肪酶不同的是，戊二醛固定化糖化酶的固載量雖大，但是活性卻不及固載量小的巰基固定化，可能是戊二醛在糖化酶的固定化中，多點(diǎn)固定占據(jù)了主要地位，所以雖然固載量大，但酶的活性卻降低了。

與常用的戊二醛法固定化酶相比，通過(guò)載體中馬來(lái)酰亞胺與巰基的點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)進(jìn)行酶的固定化，在相同實(shí)驗(yàn)條件下，固定化酶的活性、活力回收率均成倍提高，其中凝膠Ⅱ固定化脂肪酶的活力達(dá)0.82 U/mL，活力回收率達(dá)6.03%，均為戊二醛固定化酶的5倍左右，酶的穩(wěn)定性也有較大提高。

3 結(jié) 論

制備了兩種新型溫敏半互穿水凝膠載體Ⅰ和Ⅱ，這兩種水凝膠均含有相互貫穿的多孔結(jié)構(gòu)，具有大的比表面積，對(duì)溫度變化能快速響應(yīng)，是一種比較理想的固定化酶的載體。利用載體上的馬來(lái)酰亞胺基團(tuán)與酶分子上巰基的點(diǎn)擊反應(yīng)進(jìn)行酶的固定化，具有反應(yīng)選擇性高，反應(yīng)條件溫和，方法易于操作的優(yōu)點(diǎn)，而戊二醛固定化會(huì)發(fā)生多點(diǎn)結(jié)合、分子內(nèi)或分子間結(jié)合、與其他活性官能團(tuán)結(jié)合等情況使得固定化酶的活性降低。點(diǎn)擊反應(yīng)得到的固定化酶活性最高可達(dá)6.03%，是戊二醛固定化酶的5倍，且其穩(wěn)定性較好，具有很大的回收利用價(jià)值。

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