李 雁 王建明

(太原動(dòng)物園,山西太原 030009)

太原地區(qū)羅非魚紅細(xì)胞免疫功能研究

李 雁 王建明

(太原動(dòng)物園,山西太原 030009)

目的：為探討非靈長類動(dòng)物體內(nèi)是否存在紅細(xì)胞免疫功能及是否存在免疫黏附受體分子。方法：實(shí)驗(yàn)以經(jīng)濟(jì)魚類為研究對(duì)象并設(shè)計(jì)試驗(yàn),運(yùn)用熒光顯微鏡及免疫電鏡技術(shù),從細(xì)胞學(xué)水平上觀察了羅非魚紅細(xì)胞對(duì)血清致敏的綠色熒光大腸桿菌(GFP-E.coli)的免疫黏附現(xiàn)象；運(yùn)用掃描免疫電鏡對(duì)羅非魚免疫粘附現(xiàn)象進(jìn)行觀察,并通過細(xì)胞花環(huán)試驗(yàn)對(duì)太原地區(qū)代表性養(yǎng)殖魚塘中的羅非魚進(jìn)行了紅細(xì)胞免疫功能的測(cè)定；選用本實(shí)驗(yàn)自制提取的黃芪雜多糖拌料投喂羅非魚,觀測(cè)黃芪雜多糖的免疫增強(qiáng)作用。結(jié)論：羅非魚紅細(xì)胞具有免疫粘附功能且以高劑量700mg/kg飼料的劑量拌料投喂,可增強(qiáng)羅非魚紅細(xì)胞免疫功能。

魚紅細(xì)胞；免疫粘附；黃芪雜多糖

目前，人類醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中已成形成完整的紅細(xì)胞免疫系統(tǒng)概念，大量的研究證實(shí)其在體內(nèi)廣泛地參與特異性與非特異性免疫、機(jī)體免疫調(diào)控，而紅細(xì)胞CR1是紅細(xì)胞免疫功能最重要的物質(zhì)基礎(chǔ)。然而，縱觀動(dòng)物紅細(xì)胞免疫研究進(jìn)展，對(duì)于非靈長類動(dòng)物體內(nèi)是否存在紅細(xì)胞免疫黏附現(xiàn)象以及免疫黏附現(xiàn)象是否由CR1與活化的補(bǔ)體成分之間的反應(yīng)來介導(dǎo)等方面的問題仍然存在爭(zhēng)議。因此，本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)以主要經(jīng)濟(jì)魚類羅非魚為研究對(duì)象，運(yùn)用顯微技術(shù)及免疫學(xué)相關(guān)方法來探討魚類紅細(xì)胞免疫黏附功能及其分子基礎(chǔ)，以期能為動(dòng)物紅細(xì)胞免疫研究提供參考。

1 試驗(yàn)材料

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

尼羅羅非魚（太原市金勝村），紅尾羅非魚（太原市吳家堡村），熒光大廠桿菌（GFP-E.coli）為實(shí)驗(yàn)室凍存，釀酒酵母（Saccharomyces cereviseae）為本實(shí)驗(yàn)室保存菌。

1.2 主要試劑、儀器

黃芪雜多糖：本實(shí)驗(yàn)室粗提粉。

雷公藤多甙片（10mg/片）：上海復(fù)旦復(fù)華藥業(yè)有限公司，批號(hào)：100308。

EDTA抗凝管（湖南三力醫(yī)藥器械廠），淋巴細(xì)胞分離液（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所研制），戊二醛（成都科龍化工試劑廠，分析純），PBS（0.1mol/L，pH=7.4），PBSB（10mM的葡萄糖和0.1%的BSA），0.9%NaCl，新鮮兔血清，LB液體培養(yǎng)基，LB固體培養(yǎng)基，氨芐青霉素（100μg/mL），LB液體培養(yǎng)基（含100μg/mL氨芐青霉素），LB固體培養(yǎng)基（含100μg/mL氨芐青霉素）；梯度酒精（30%、50%、70%、80%、90%、95%、100%），鋨酸（北京恒業(yè)中遠(yuǎn)化工廠），環(huán)氧樹脂Epon812（北京恒業(yè)中遠(yuǎn)化工廠）；酸度計(jì)（HANNA，pH211），熒光顯微鏡（BX51TF，Japan），掃描電鏡（JSM-6400，Japan），濺射噴金儀（JFC-1600，Japan）

2 試驗(yàn)步驟

2.1 羅非魚血清制備

選取健康、個(gè)體均勻羅非魚個(gè)體，尾靜脈采血，EDTA抗凝，按照血液：淋巴細(xì)胞分離液=1：2的比例將血液緩慢加入分離液表面，分離血清，血清標(biāo)明品種保存?zhèn)溆茫?/p>

2.2 羅非魚紅細(xì)胞懸液制備

取上述紅細(xì)胞沉淀，用生理鹽水洗滌、離心2次（2 000 r/ min，5 min），配制成濃度為1.5×107／mL的紅細(xì)胞懸液。

2.3 熒光大腸桿菌制備

（1）GFP-E.coli復(fù)蘇與純化

取試管加入5mL的LB液體培養(yǎng)基，將凍存GFP-E.coli接種于培養(yǎng)基中，37℃，220rpm振蕩培養(yǎng)13h，再轉(zhuǎn)入含100μg/ml氨芐青霉素鈉的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜。挑取培養(yǎng)的菌懸液在含100μg/ml氨芐青霉素鈉的LB固體培養(yǎng)基上接種，37℃培養(yǎng)箱中過夜，取單菌落接種于含100μg/ml氨芐青霉素鈉的LB液體培養(yǎng)基振蕩培養(yǎng)過夜。利用倍比稀釋方法制備梯度菌液，分別涂板，選長出菌落范圍在20～200板計(jì)算菌濃度。

公式一：

每管細(xì)菌濃度（個(gè)/ml）=（三個(gè)重復(fù)板菌落數(shù)的和/3）×稀釋倍數(shù)×10

公式二：

細(xì)菌總濃度（個(gè)/ml）=各管細(xì)菌濃度的平均值

（2） GFP-E.coli的致敏：

取濃度為1.68×109/mL的GFP-E.coil懸液100μl，與0.9mL的新鮮羅非魚血清混勻，于37℃下孵育1h，孵育完畢，2000rmp離心5min。棄去上清，菌重懸于PBSB中，涂片鏡檢，無異常備用。

2.4 羅非魚紅細(xì)胞免疫粘附光鏡觀察

取尼羅羅非魚紅細(xì)胞懸液離心洗滌兩次，重懸后鏡檢無異常備用。分別取3支EP管，編號(hào)為A、B、C。三管中各加入500μl紅細(xì)胞懸液。A管中加入致敏GFP-E.coli懸液，B管中加入未致敏處理的GFP-E.coil菌液，C管中加入PBS，37℃，70r/min振蕩孵育1h，孵育完畢后1500r/min，5min，離心洗滌兩次，洗滌時(shí)候，特別注意動(dòng)作要輕柔。PBSB重懸，涂片，熒光顯微鏡檢。

紅尾羅非魚紅細(xì)胞處理同上。

2.5 羅非魚紅細(xì)胞免疫粘附電鏡觀察

（1）分別取尼羅羅非魚、紅尾羅非魚致敏GFP-E.coli孵育組細(xì)胞懸液；

（2）1500rpm，離心5min，棄去上清；

（3）用2～3%的戊二醛固定1.5h；

（4）用磷酸緩沖液清洗3次，每次5min；

（5）用50%、70%、80%、90%乙醇梯度脫水，各梯度10min，再用100%乙醇脫水3次，每次30min；

（6）用叔丁醇置換3次，每次30min；

（7）用冷凍干燥儀干燥樣品；

（8）用雙面膠帶將樣品粘到樣品臺(tái)上；

（9）用離子濺射儀給樣品鍍10nm金膜，上鏡觀察。

2.6 羅非魚紅細(xì)胞免疫粘附花環(huán)試驗(yàn)

（1）酵母的制備

將酵母多糖試劑用生理鹽水洗滌，配成1×108/ml 細(xì)胞懸液，分為兩份，一份加等量羅非魚血清混勻，37℃，30min，洗滌并恢復(fù)原濃度，另一份不做處理，備用。

（2）紅細(xì)胞受體（RBC-C3bR）花環(huán)試驗(yàn)

取致敏酵母多糖懸液分別與尼羅羅非魚、紅尾羅非魚紅細(xì)胞懸液各50μL混合。37℃，水浴30 min，然后加入pH 值為7. 2的Hank’s液100μl，混勻；再加入4%的多聚甲醛25μl，固定5 min；平行涂片2張，自然干燥，甲醇固定2 min，再用Wright-Giemsa復(fù)合染色30 min；高倍鏡檢，以1個(gè)紅細(xì)胞粘附2個(gè)或2個(gè)以上酵母者為1個(gè)花環(huán)，計(jì)數(shù)200個(gè)紅細(xì)胞，求出花環(huán)率。

（3）紅細(xì)胞免疫復(fù)合物（RBC一ICR）花環(huán)試驗(yàn)

取非致敏酵母懸液分別于尼羅羅非魚、紅尾羅非魚紅細(xì)胞懸液50μl混合，37℃，水浴30 min，然后加入pH 值為7. 2 的Hank’s液100μl，混勻；再加入4%的多聚甲醛25μl，固定5 min；平行涂片2張，自然干燥，甲醇固定2 min，再用Wright-Giemsa復(fù)合染色30 min；高倍鏡檢，以1個(gè)紅細(xì)胞粘附2個(gè)或2個(gè)以上酵母者為1個(gè)花環(huán)，計(jì)數(shù)200個(gè)紅細(xì)胞，求出花環(huán)率。

2.7 中藥飼料添加劑對(duì)羅非魚紅細(xì)胞免疫粘附的影響

選用本實(shí)驗(yàn)室提取精制的黃芪多糖為中藥添加劑，兩品種羅非魚均按照單因素完全隨機(jī)設(shè)計(jì)，隨機(jī)分為4組，每組8尾，另取8尾作為空白對(duì)照組，第Ⅰ組為空白對(duì)照組，第II、III組為實(shí)驗(yàn)組（AHPS高、低劑量處理組），拌料投喂（見表1）。

表1 試驗(yàn)分組及處理

于最后一天拌料投喂結(jié)束，全群羅非魚采血，分組標(biāo)記，按照2.6試驗(yàn)操作，計(jì)算各組紅細(xì)胞花環(huán)率。

3 試驗(yàn)結(jié)果

3.1 GFP-E.coli鏡檢結(jié)果

GFP-E.coli經(jīng)過復(fù)蘇純化，在菌體內(nèi)表達(dá)綠色熒光蛋白。在熒光場(chǎng)下，綠色熒光清晰可見。GFP-E.coli電鏡下觀察，結(jié)果顯示GFP-E.coli呈短棒狀，兩端鈍圓，長度約為2～3μm。表明，凍存GFP-E.coli復(fù)蘇成功，生長良好，且能夠被激發(fā)出綠色熒光，可以作為粘附報(bào)告因子以用于后續(xù)試驗(yàn)。

3.2 羅非魚紅細(xì)胞免疫粘附光鏡觀察

GFP-E.coli經(jīng)新羅非魚血清致敏，于37℃下與紅細(xì)胞孵育后，涂片鏡檢。鏡檢結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在紅細(xì)胞表面可清晰觀察到綠色熒光，說明被新血清致敏后的GFP-E.coli，可以被紅細(xì)胞黏附，所以能夠在紅細(xì)胞表面觀察到GFP-E.coli體內(nèi)表達(dá)的綠色熒光，充分說明羅非魚紅細(xì)胞可以免疫黏附經(jīng)血清補(bǔ)體作用過的GFP-E. coli；

未經(jīng)新鮮羅非魚清致敏的GFP-E.coli與紅細(xì)胞孵育之后，涂片鏡檢。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在羅非魚紅細(xì)胞表面未能觀察到綠色熒光，只可見紅細(xì)胞洗滌之后殘留下的少數(shù)GFP-E.coli，因此在視野中也可以觀察到綠色熒光，這就表明紅細(xì)胞與未經(jīng)新鮮血清致敏的GFP-E.coli并未發(fā)生免疫黏附現(xiàn)象。

圖1 如A中箭頭所指，可以看出尼羅羅非魚紅細(xì)胞與GFP-E.coli兩者發(fā)生免疫黏附（1000×）；B中箭頭所指為尼羅羅非魚紅細(xì)胞及殘留的少數(shù)GFP-E.coli菌體，兩者之間分散存在，沒有發(fā)生免疫黏附現(xiàn)象（1000×）；C中可以看出紅尾羅非魚紅細(xì)胞與GFP-E.coli兩者發(fā)生免疫黏附（1000×），D中可以看出紅尾羅非魚紅細(xì)胞及殘留少數(shù)GFP-E.coli菌體，兩者之間分散存在，沒有發(fā)生免疫黏附現(xiàn)象（1000×）。

3.3 羅非魚紅細(xì)胞免疫粘附掃描電鏡觀察

經(jīng)新鮮羅非魚血清致敏后的GFP-E.coli與紅細(xì)胞孵育，電鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，掃描電鏡下能夠清楚地看到紅細(xì)胞表面黏附有數(shù)量不等的GFP-E.coli。由此可見，兩個(gè)品種的羅非魚紅細(xì)胞能夠黏附經(jīng)血清致敏的GFP-E.coli。

圖4 作圖為掃描電鏡下尼羅羅非魚紅細(xì)胞黏附著數(shù)量不等的致敏GFP-E.coli（8000×），右圖為紅尾羅非魚紅細(xì)胞粘附現(xiàn)象

3.4 羅非魚紅細(xì)胞花環(huán)試驗(yàn)

花環(huán)試驗(yàn)結(jié)果表明，致敏酵母菌可與羅非魚紅細(xì)胞形成花環(huán)，未致敏酵母菌可與紅細(xì)胞形成花環(huán)，尼羅羅非魚、紅尾羅非魚紅細(xì)胞免疫粘附受體花環(huán)率依次為：31.80±1.86、30.09±1.67，IC花環(huán)率依次為24.40±1.41、23.36±2.64。

表2 羅非魚花環(huán)率結(jié)果

3.5 中藥飼料添加劑對(duì)羅非魚紅細(xì)胞免疫粘附的影響

結(jié)果顯示，尼羅羅非魚空白對(duì)照組、高劑量組、低劑量組RBC-C3bR依次為31.80±1.8、42.16±3.22、38.83±1.17，其RBC-ICR值依次為24.40±1.41、23.28±3.32、24.04±2.66；紅尾羅非魚空白對(duì)照組、高劑量組、低劑量組RBC-C3bR依次為30.09 ±1.67、40.39 ±2.51、36.23 ±1.08，其RBC-ICR值依次為23.36±2.64、22.64±2.81、23.04±1.06，（見表3，表4）。

表3 黃芪雜多糖對(duì)尼羅羅非魚花環(huán)率影響結(jié)果

表4 黃芪雜多糖對(duì)紅尾羅非魚花環(huán)率影響結(jié)果

4 分析討論

4.1 羅非魚紅細(xì)胞免疫黏附試驗(yàn)結(jié)果分析

人紅細(xì)胞表面的補(bǔ)體受體分子可以結(jié)合補(bǔ)體致敏的免疫復(fù)合物、病毒、細(xì)菌等外源分子，稱之免疫黏附（immune adhere，IA）。免疫黏附是紅細(xì)胞的最重要的免疫功能，因此免疫黏附受體是紅細(xì)胞免疫深入研究的基石。Duke（1930）首次觀察到靈長類動(dòng)物的紅細(xì)胞能夠結(jié)合血清致敏的錐蟲[32]。此后，R. A. Nelson研究表明紅細(xì)胞免疫黏附功能受血清中的補(bǔ)體成分complement 3（C3），complement 4（C4）的介導(dǎo)[33]，其中補(bǔ)體C3的作用更為明顯[88]。細(xì)菌、病毒等分子進(jìn)入血液后激活補(bǔ)體系統(tǒng)，導(dǎo)致C3與酶分子內(nèi)硫酯結(jié)合，發(fā)生親核反應(yīng)，引起C3裂解為具有高活性的C3b片段[5]。通過C3b包被在外源分子表面完成對(duì)外源分子的致敏并形成免疫復(fù)合物（Immune complex，IC），進(jìn)而人紅細(xì)胞通過其表面補(bǔ)體受體與C3b特異性結(jié)合將致敏分子黏附于紅細(xì)胞表面，可見介導(dǎo)紅細(xì)胞免疫黏附的并不是C3本身，而是其酶解產(chǎn)物C3b[34]。國內(nèi)上世紀(jì)九十年代，陳思義，王旭東等人沿用人醫(yī)理論，探討了牛、雞、犬等不同動(dòng)物的紅細(xì)胞花環(huán)率[21][25][26][28]。但是縱觀而言，動(dòng)物紅細(xì)胞免疫黏附受體的研究仍然存在方法單一的問題，進(jìn)而限制了動(dòng)物紅細(xì)胞免疫的研究步伐。

本實(shí)驗(yàn)中，用新鮮血清致敏GFP E.coli，GFP E.coli激活血清中補(bǔ)體成分，產(chǎn)生的補(bǔ)體活性片段包被于GFP E.coli表面，進(jìn)而與紅細(xì)胞表面特異性補(bǔ)體受體結(jié)合，發(fā)生黏附。由于紅細(xì)胞表面黏附有GFP E.coli，因此在熒光顯微鏡下可見致敏GFP-Ecoil孵育組紅細(xì)胞表面帶有綠色熒光，結(jié)果證實(shí)豬紅細(xì)胞膜表面存在可以特異結(jié)合補(bǔ)體活性片段的活性分子即膜補(bǔ)體受體分子。未經(jīng)血清致敏的GFP E.coli由于失去補(bǔ)體活性片段的介導(dǎo)而不能與紅細(xì)胞表面的補(bǔ)體受體分子結(jié)合，進(jìn)而不能被紅細(xì)胞免疫黏附。所以，GFPEcoil未致敏孵育組紅細(xì)胞表面未能觀察到綠色熒光。由此可見，豬紅細(xì)胞膜表面存在特異性免疫黏附受體——膜補(bǔ)體受體分子，而且紅細(xì)胞與致敏病原粒子之間的免疫黏附屬于抗原抗體反應(yīng)，即紅細(xì)胞膜補(bǔ)體受體分子具有特異性，這也正是前人研究中紅細(xì)胞花環(huán)的物質(zhì)基礎(chǔ)。

本實(shí)驗(yàn)采用掃描免疫電鏡進(jìn)一步觀察了紅細(xì)胞與GFP E.coli的免疫黏附現(xiàn)象。掃面電鏡結(jié)果可見羅非魚紅細(xì)胞表面黏附有數(shù)量不等的致敏GFP E.coli，表明紅細(xì)胞表面存在有特異性免疫黏附受體—膜補(bǔ)體受體，其可以與致敏GFP E.coli表面的補(bǔ)體活性成分特異性地結(jié)合，進(jìn)而致敏GFP E.coli被紅細(xì)胞黏附于表面，說明紅細(xì)胞與致敏GFP E.coli之間是特異性地結(jié)合，而非外力因素干擾所致。

本實(shí)驗(yàn)采用基因工程菌的綠色熒光作為報(bào)告因子，不需要特殊染色或標(biāo)記，可以在熒光場(chǎng)下直接觀察紅細(xì)胞對(duì)致敏GFP E.coli的免疫黏附作用，而且實(shí)驗(yàn)中利用電子顯微鏡從微觀上觀察紅細(xì)胞黏附致敏GFP E.coli的現(xiàn)象，進(jìn)而提高了紅細(xì)胞免疫黏附結(jié)果的精確性和科學(xué)性。

4.2 羅非魚紅細(xì)胞免疫粘附功能測(cè)定

本試驗(yàn)結(jié)果表明，這兩品種羅非魚紅細(xì)胞上均存在免疫粘附受體，從而羅非魚紅細(xì)胞具有重要的免疫功能；進(jìn)一步提示，由于種屬相近，其紅細(xì)胞上粘附受體的數(shù)量無顯著差異。正常羅非魚紅細(xì)胞粘附受體花環(huán)率高于紅細(xì)胞免疫復(fù)合物花環(huán)率，這是因?yàn)樵谡Ｇ闆r下.體內(nèi)形成的抗原一抗體一補(bǔ)體復(fù)合物及C3自然分解產(chǎn)生的C3b 均較少，因而占位的粘附受體較少.故紅細(xì)胞粘附受體花環(huán)率明顯高于紅細(xì)胞免疫復(fù)合物花環(huán)率。這與郭峰等人報(bào)道的人及動(dòng)物紅細(xì)胞花環(huán)率結(jié)果相似。

4.3 中藥飼料添加劑對(duì)羅非魚紅細(xì)胞免疫粘附的影響

從結(jié)果中看出，尼羅羅非魚黃芪多糖高劑量、低劑量投喂組其紅細(xì)胞花環(huán)率相比空白組有顯著提高（P＜0.05）；紅尾羅非魚黃芪多糖高劑量、低劑量投喂組其紅細(xì)胞花環(huán)率相比空白組亦有顯著提高（P＜0.05），兩品種羅非魚均以以700mg/kg劑量拌料投喂免疫增強(qiáng)效果較好。但是，可能由于品種差異較小或樣本數(shù)量問題，兩品種間數(shù)據(jù)未見有顯著差異。

人及動(dòng)物紅細(xì)胞C3 b 受體花環(huán)率的高低與機(jī)體健康狀況有一定關(guān)系，患惡性腫瘤、白血病、貧血、雞傳染性法氏囊病、雞馬立克氏病等疾病時(shí)，紅細(xì)胞受體花環(huán)率下降[35][36][37]。本實(shí)驗(yàn)初步證實(shí)黃芪雜多糖可以增強(qiáng)羅非魚非特異性免疫反應(yīng)，但是魚的各種疾病是否也對(duì)紅細(xì)胞粘附受體花環(huán)率有一定影響尚需進(jìn)一步探討。

5 結(jié)論

（1）太原市金勝村、吳家堡村的羅非魚紅細(xì)胞具有免疫功能，可以粘附致敏復(fù)合物，尼羅羅非魚、紅尾羅非魚的紅細(xì)胞花環(huán)率依次為31.80±1.86、30.09±1.67，可作為臨床基礎(chǔ)數(shù)據(jù)參考；

（2）黃芪雜多糖作為飼料添加劑對(duì)尼羅河羅非魚、紅尾羅非魚均具有免疫增強(qiáng)作用。

（3）本實(shí)驗(yàn)初步證實(shí)黃芪雜多糖可以增強(qiáng)羅非魚紅細(xì)胞免疫功能，但是魚的其他疾病是否也對(duì)紅細(xì)胞粘附受體花環(huán)率有一定影響尚需進(jìn)一步探討。

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