孫忠人,任雪,張秦宏,仇立波,方劍喬

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué),哈爾濱 150040;2.浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第三醫(yī)院,杭州 310000)

·動物實(shí)驗·

電針傍刺對大鼠褥瘡炎性細(xì)胞的影響

孫忠人1,任雪1,張秦宏1,仇立波1,方劍喬2

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué),哈爾濱 150040;2.浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第三醫(yī)院,杭州 310000)

目的觀察電針以及普通針刺對褥瘡模型大鼠各種炎性細(xì)胞(肥大細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、成纖維細(xì)胞)的影響,探討電針在褥瘡愈合過程中的作用機(jī)理。方法選取雄性SD大鼠75只,隨機(jī)分為模型組、針刺組和電針組,每組25只。造模后模型組每日除進(jìn)行基礎(chǔ)護(hù)理外不做其他任何處理;針刺組每日基礎(chǔ)護(hù)理同時進(jìn)行針刺治療;電針組每日基礎(chǔ)護(hù)理同時先行針刺(同針刺組),隨后連接直流電刺激儀進(jìn)行電刺激治療。每日治療1次,直到取材時間點(diǎn)當(dāng)天結(jié)束治療。每組在治療后第1、3、7、14、21 d時采用皮膚損傷面積追蹤法,觀察褥瘡損傷面積的愈合情況,并觀察不同時間點(diǎn)各種炎性細(xì)胞組織切片的組織學(xué)、形態(tài)學(xué)變化,同時各組進(jìn)行肥大細(xì)胞計數(shù)。結(jié)果與模型組相比,針刺組大鼠在褥瘡面積變化方面無顯著性差異(P＞0.05);電針組中褥瘡面積平均值明顯變小,具有顯著性差異(P＜0.05),且電針組大鼠在整個炎癥反應(yīng)過程中的各個時間點(diǎn)上,肥大細(xì)胞在致密度和脫顆粒程度上明顯提前于模型組,中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞聚集出現(xiàn)的時間均早于模型組,隨后出現(xiàn)的成纖維細(xì)胞聚集現(xiàn)象也提前于模型組。與針刺組相比,電針療法可以明顯降低褥瘡面積的平均值,促使肥大細(xì)胞脫顆粒提前,具有顯著性差異(P＜0.05),并能加速中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的聚集,使成纖維細(xì)胞聚集修復(fù)的時間提前。3組內(nèi)部5個不同時間點(diǎn)比較,①褥瘡面積方面,電針組面積平均值在治療14 d時變化顯著,與其余時間點(diǎn)比較具有顯著性差異(P＜0.05);模型組和針刺組面積平均值在治療21 d時變化顯著,與其余時間點(diǎn)比較具有顯著性差異(P＜0.05);②肥大細(xì)胞數(shù)目方面,電針組在治療3 d時達(dá)到最高值,與其余時間點(diǎn)比較具有顯著性差異(P＜0.05);模型組和針刺組在治療7 d時達(dá)到最高值,與其余時間點(diǎn)比較具有顯著性差異(P＜0.05)。結(jié)論電針傍刺療法可以明顯減少褥瘡的面積,縮短褥瘡愈合的時間。電針療法可通過加速肥大細(xì)胞脫顆粒進(jìn)程來縮短炎癥反應(yīng)啟動時間,并能加快巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的聚集吞噬作用來促進(jìn)成纖維細(xì)胞的聚集修復(fù),迅速促進(jìn)大鼠褥瘡愈合,這可能是電針治療大鼠褥瘡的作用機(jī)制之一。

電針;傍刺法;褥瘡;炎性細(xì)胞

褥瘡又名“壓瘡”、“席瘡”、“壓迫性潰瘍”,其早期的定義為“局部組織持續(xù)受壓后發(fā)生的缺血性壞死”,隨著人們對褥瘡發(fā)生機(jī)制的不斷研究和臨床實(shí)踐,褥瘡的定義也逐漸被更新為“由壓力、剪切力或摩擦力導(dǎo)致的皮膚、肌肉或皮下組織的局限性損傷,常發(fā)生在骨隆突處”。傳統(tǒng)上對于褥瘡的治療多體現(xiàn)在清創(chuàng)、瘡面覆蓋無菌敷料等措施,被動的等待傷口愈合,但是往往因其瘡口遷延不愈或愈合速度較慢,且易引起全身感染,嚴(yán)重者可引發(fā)敗血癥而成為臨床上常見的難題。如何縮短治療時間,提高患者的生存質(zhì)量,減輕護(hù)理人員的負(fù)擔(dān)成為目前臨床上亟待解決的問題。本實(shí)驗通過對褥瘡創(chuàng)面愈合的速度及褥瘡大鼠的致死率來觀察電針傍刺及單純傍刺在褥瘡愈合過程中的作用,評價其療效,努力為褥瘡的愈合提供新的臨床治療思路和手段,現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗動物與分組

健康SD大鼠75只,由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)動物實(shí)驗中心提供,體重250～300 g,在標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗室條件(12 h光線,12 h明暗周期)下飼養(yǎng)。采用隨機(jī)數(shù)字表法將其隨機(jī)分為模型組、針刺組和電針組,每組25只。造模前3組每籠飼養(yǎng)5只,造模后均單籠飼養(yǎng)。

1.1.2 實(shí)驗儀器與試劑

體重秤(上海梅特勒-托利多儀器有限公司)、KP-21C智能求積儀(heijima,nagaoka-shi,niigata, Japan)、G6805-B電刺激儀(上海欣曼科教設(shè)備有限公司)、華佗牌0.25 mm×13 mm針灸針(蘇州醫(yī)療用品廠有限公司)、真空干燥箱(DZG-6020,上海森信實(shí)驗儀器有限公司)、超低溫冰箱(702 ULT FREEZER,USA)、電熱恒溫水浴鍋(HH Sy21-Ni,北京長風(fēng)儀器儀表廠)、光學(xué)顯微鏡(日本OLYMPUS公司)。

1.2 方法

1.2.1 模型制備[1]

①采用腹腔注射10%水合氯醛(350 mg/kg)麻醉。取大鼠左側(cè)臥位,在脊柱旁開1 cm處,以右側(cè)肋骨為中心的4 cm×8 cm范圍內(nèi),進(jìn)行脫毛處理(電動剃須刀剃除后用中性脫毛膏涂抹,10 min后擦掉脫毛膏,用乙醇和碘伏清潔局部皮膚)。然后在大鼠背部靠頭端距正中線1 cm處(約第一肋骨水平)做一深至筋膜、長約3 cm的橫向切口。②鈍性剝離組織,將皮膚和肌肉分開,剝離范圍控制在4 m×3 cm內(nèi),將體積為4 cm×2.5 cm ×0.07 cm的鋼片植入大鼠右肩部的皮下,所有鐵片均高壓滅菌并溫箱(70℃,2 h)烤干,植入成功后用6-0 Dexon聚羥基乙酸線縫合切口,再用碘伏消毒、青霉素沖洗以防止感染。③術(shù)后24 h在鋼片植入處的皮膚表面放置磁鐵。磁鐵磁通量為1250 GS(磁通量的選擇是根據(jù)誘導(dǎo)潰瘍的流體靜力壓推導(dǎo)出來的,研究表明,當(dāng)外加壓力超過局部毛細(xì)血管的壓力(12～32 mmHg)時,就可誘導(dǎo)潰瘍。而外加壓力約為50 mmHg最合適[1]。④開始皮膚缺血-再灌注損傷循環(huán),即外源所壓磁鐵對皮膚產(chǎn)生壓力,造成局部組織缺血,磁鐵對皮膚產(chǎn)生壓力,造成局部組織缺血,每次缺血2 h后再將外源磁鐵取下,讓局部血流恢復(fù)30 min。如此循環(huán),每日每只大鼠進(jìn)行5個連續(xù)的循環(huán),連續(xù)2 d?？傆嬋毖?再灌注10個循環(huán),缺血時間20 h。缺血再灌注過程中大鼠自由進(jìn)食、飲水,單籠飼養(yǎng)。⑤模型成功標(biāo)準(zhǔn),以皮膚變黑、糜爛,全層皮膚組織損傷,有壞死組織但深度不明顯,作為判斷Ⅲ期壓瘡形成的標(biāo)準(zhǔn)[2]。

1.2.2 實(shí)驗處理

在開始治療后的第1、3、7、14、21 d分別將各組5只大鼠麻醉后取出受損傷的皮膚組織。

①模型組,采用單籠飼養(yǎng),每日除進(jìn)行基礎(chǔ)護(hù)理外不做其他任何處理。在規(guī)定療程內(nèi)每天隨同電針組和針刺組一樣抓取捆綁1次,捆綁固定時間為30 min,不予針刺治療,也不通電。②針刺組,采用單籠飼養(yǎng),每日基礎(chǔ)護(hù)理同時進(jìn)行針刺治療。采用傍刺法,針刺位置位于瘡面中央位置,直刺深度0.2寸;同時距離瘡面外緣正常皮膚處,平刺深度0.2寸,不通電,留針30 min。每日1次。③電針組,采用單籠飼養(yǎng),每日基礎(chǔ)護(hù)理同時先行針刺(同針刺組),隨后連接直流電刺激儀進(jìn)行電刺激治療,選擇電流1 mA,頻率為1 HZ,波形為疏密波[3],通電時間為30 min[4]。每日治療1次,直到取材時間點(diǎn)當(dāng)天結(jié)束治療。

實(shí)驗期間各組大鼠均是普通飼料喂養(yǎng),自由攝食和飲水,每日更換飼料和飲水,勤換墊料,保持大鼠清潔的生存環(huán)境。針刺組和電針組治療的同時,模型組大鼠亦固定于鼠板。

1.2.3 樣品的處理及檢測方法

分別在治療開始后第1、3、7、14、21 d,每組5 只,采用硫酸鹽薄膜勾勒出損傷組織的周長,并用記號筆作標(biāo)記。運(yùn)用Planimter(PLANIX7)求積儀測量損傷區(qū)域的面積。為了提高精確度,每處損傷處追蹤3次,測量3次,然后求均值。

1.2.4 組織的固定包埋

在治療后第1、3、7、14、21 d,每組5只,面積測量結(jié)束后進(jìn)行局部組織取材,后經(jīng)10%甲醛固定24 h,再進(jìn)入脫水、透明、浸蠟程序后,進(jìn)行石蠟包埋;切片厚度為4 μm,方向為組織塊縱切面;經(jīng)60℃恒溫箱烤片3 h后,再將切片脫蠟、染色、脫水、透明、封固、觀察。光鏡下觀察組織切片的病理學(xué)組織形態(tài)學(xué)變化并隨機(jī)攝片,觀察肥大細(xì)胞的切片用甲苯胺藍(lán)染色法進(jìn)行計數(shù),其他3種炎性細(xì)胞運(yùn)用HE染色法后進(jìn)行鏡下觀察。

1.2.5 肥大細(xì)胞的染色原理、步驟及計數(shù)方法

肥大細(xì)胞一般較大,直徑約20～30 μm,呈圓形或橢圓形,胞核較小,圓形,胞質(zhì)內(nèi)充滿粗大并有異染性的圓形嗜堿性顆性,這種顆粒屬硫酸酯呈異色性, 在HE染色中不明顯,會和其他的細(xì)胞質(zhì)一樣被曙紅染成紅色,故用甲苯胺藍(lán)法將肥大細(xì)胞顆粒染成紅紫色(即所謂異色性),其他組織藍(lán)色(正色性)。

染色步驟如下,組織切片常規(guī)脫蠟至水。入甲苯胺藍(lán)夜30 min。少水洗,洗去多余染液。入冰醋酸液分化,直到胞核和顆粒清晰。稍水洗,用冷風(fēng)吹干。二甲苯透明,中性樹膠封固。

肥大細(xì)胞染色以胞質(zhì)出現(xiàn)紫藍(lán)色顆粒為陽性反應(yīng),其計數(shù)方法參照Molin[5]法,每例標(biāo)本隨機(jī)選擇10個高倍視野(HPF,400×),進(jìn)行觀察并計數(shù)肥大細(xì)胞,然后求出每個標(biāo)本切片肥大細(xì)胞的平均數(shù),以每高倍鏡視野中肥大細(xì)胞數(shù)目加減標(biāo)準(zhǔn)差表示不同類型組織的肥大細(xì)胞數(shù)目(肥大細(xì)胞數(shù)目±S/HPF)。

1.2.6 巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、成纖維細(xì)胞的染色原理及步驟

HE染色法即蘇木精-伊紅染色法,蘇木精染液為堿性,主要使細(xì)胞核內(nèi)的染色質(zhì)與胞質(zhì)內(nèi)的核糖體著紫藍(lán)色,伊紅為酸性染料,主要使細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞外基質(zhì)中的成分著紅色。細(xì)胞核被蘇木精染成鮮明的藍(lán)色,軟骨基質(zhì)、鈣鹽顆粒呈深藍(lán)色,黏液呈灰藍(lán)色。細(xì)胞漿被伊紅染成深淺不同的粉紅色至桃紅色,胞漿內(nèi)嗜酸性顆粒呈反光強(qiáng)的鮮紅色。膠原纖維呈淡粉紅色,彈力纖維呈亮粉紅色,紅血球呈橘紅色,蛋白性液體呈粉紅色。

染色步驟如下,切片以二甲苯脫蠟,梯度乙醇脫水。入蘇木素染色5 min。入1%鹽酸乙醇溶液分化5 s。入自來水藍(lán)化30 min。入1%伊紅染夜1 min。逐級乙醇脫水(70%,80%,95%Ⅰ,95%Ⅱ,100%Ⅰ,100%Ⅱ)。二甲苯透明(二甲苯Ⅰ5 min,二甲苯Ⅱ5 min)。中性樹膠封片。

1.2.7 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS17.0進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析,對計量資料先行方差齊性分析后,組間比較運(yùn)用單因素方差分析,并進(jìn)行多重比較,計量結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果

2.1 電針傍刺對大鼠褥瘡面積的影響

由表1可見,電針組分別與模型組和針刺組相比,電針療法可以明顯降低大鼠褥瘡的面積,提高褥瘡的愈合質(zhì)量,具有顯著性差異(P＜0.05);針刺組與模型組相比,針刺組在褥瘡愈合面積方面的差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。

表1 電針傍刺對大鼠褥瘡面積平均值的影響(±s,mm2)

表1 電針傍刺對大鼠褥瘡面積平均值的影響(±s,mm2)

注:與模型組比較1)P＜0.05;與針刺組比較2)P＜0.05

組別 n 面積電針組 25 314.61±102.611)2)針刺組 25 421.33±140.60模型組 25 454.11±174.72

由表1、2可見,3組在褥瘡面積比較方面,電針組面積平均值在治療14 d時變化顯著,與其他4個時間點(diǎn)比較,差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01),其余4個時間點(diǎn)之間比較,差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05);模型組和針刺組面積平均值在治療21 d時變化顯著,與其他4個時間點(diǎn)比較,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01),其余4個時間點(diǎn)之間比較,差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。

表2 各組大鼠褥瘡面積在5個不同時相的比較 (±s,mm2)

表2 各組大鼠褥瘡面積在5個不同時相的比較 (±s,mm2)

注:與同組7 d比較1)P＜0.01;與同組14 d比較2)P＜0.01,3)P＜0.01

組別 n 1 d 3 d 7 d 14 d 21 d模型組 25 528.53±101.41496.46±111.32457.32±147.27331.28±60.17 71.97±33.832)針刺組 25 531.39±119.39512.18±149.18429.37±120.82328.76±53.49 69.34±42.893)電針組 25 517.20±107.48485.46±136.26387.36±102.45 115.51±40.291)47.24±20.52

2.2 肥大細(xì)胞計數(shù)及結(jié)構(gòu)形態(tài)的變化

采用甲苯胺藍(lán)法顯示肥大細(xì)胞,可見肥大細(xì)胞體積較大,胞質(zhì)內(nèi)有紫蘭色顆粒,通過對比三組在5個時間點(diǎn)下的組織形態(tài)學(xué)變化發(fā)現(xiàn),模型組在治療的第1 d時均在炎癥中心皮下結(jié)締組織內(nèi)可見成簇或成串的肥大細(xì)胞分布,細(xì)胞形態(tài)多樣,呈圓形、橢圓形,無突起,胞漿染為藍(lán)紫色,胞膜清晰完整,胞質(zhì)均勻,內(nèi)有致密深藍(lán)色顆粒;在第3、7 d時炎癥病灶局部組織表皮呈隆起的波浪狀,真皮層增厚,皮下結(jié)締組織有大量肥大細(xì)胞聚集并向真皮層延伸,胞漿染為深藍(lán)色,大部分肥大細(xì)胞可見脫顆?，F(xiàn)象,胞膜破潰,顆粒漏出胞膜遍布于組織間隙,細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則,輪廓模糊;在第14 d鏡下可見肥大細(xì)胞數(shù)量明顯減少,脫顆粒現(xiàn)象不明顯,提示肥大細(xì)胞進(jìn)入凋亡狀態(tài);第21 d時可見病灶局部皮下結(jié)締組織有散在肥大細(xì)胞,染色較淺,幾乎沒有脫顆?，F(xiàn)象,提示褥瘡已經(jīng)進(jìn)入恢復(fù)期。與模型組相比較,電針組大鼠在整個炎癥反應(yīng)過程中的各個時間點(diǎn)上,肥大細(xì)胞在致密度和脫顆粒程度上明顯提前于模型組,針刺組次之,如在治療第1 d和第3 d時,電針組中肥大細(xì)胞的脫顆?，F(xiàn)象最為明顯,局部炎癥反應(yīng)也比較清晰,而在治療第7 d時,電針組中鏡下情況類似于空白組14 d時,而在其治療的第14 d時僅能觀察到少數(shù)的肥大細(xì)胞,說明炎癥已經(jīng)在恢復(fù)期。

表3 各組大鼠褥瘡局部肥大細(xì)胞數(shù)在5個不同時相的比較 (±s)

表3 各組大鼠褥瘡局部肥大細(xì)胞數(shù)在5個不同時相的比較 (±s)

注:與同組治療3 d比較1)P＜0.05;與同組治療7 d比較2)P＜0.05

組別 n 1 d 3 d 7 d 14 d 21 d模型組 25 14.30±3.46 18.76±3.32 20.35±3.14 11.28±3.432)11.97±3.832)針刺組 25 14.39±2.39 17.18±2.18 21.24±2.06 12.76±2.422)9.84±1.652)電針組 25 18.32±1.35 21.48±1.27 12.70±1.481)9.33±2.801)5.27±1.721)

由表3可見,電針組在治療3 d時肥大細(xì)胞數(shù)目達(dá)到最高值,與同組治療7、14、21 d相比較,差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);空白組和針刺組在治療7 d時肥大細(xì)胞數(shù)目達(dá)到最高值,與同組治療14、21 d相比較,差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05),說明電針組大鼠在整個炎癥反應(yīng)過程中能促使肥大細(xì)胞脫顆粒提前,在各個時間點(diǎn)上肥大細(xì)胞致密度和脫顆粒程度明顯提前于模型組和針刺組。

2.3 巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞的組織形態(tài)學(xué)變化

電針組在治療第1 d時可見組織周圍間質(zhì)有巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞聚集,即炎性細(xì)胞浸潤現(xiàn)象,巨噬細(xì)胞一般體積較大,為圓形或橢圓形,染色較深,核內(nèi)的結(jié)構(gòu)看不清;中性粒細(xì)胞呈圓形,胞質(zhì)中含有大量的細(xì)小顆粒,提示局部創(chuàng)面有炎癥反應(yīng);在第3 d時炎癥病灶周圍的巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞聚集程度達(dá)到最高峰,皮下結(jié)締組織中有大量巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞聚集并向真皮層延伸,細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則,輪廓模糊,內(nèi)含有許多顆粒或空泡;在第7 d鏡下可見巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞數(shù)量明顯減少;第14 d時可見病灶局部皮下巨噬細(xì)胞幾乎消失,染色較淺。

模型組和針刺組在治療第1、3、7 d時間段中,巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞聚集程度逐漸增加,第7 d時巨噬細(xì)胞浸潤現(xiàn)象最為明顯,局部炎癥反應(yīng)也比較清晰,而在治療第14 d時鏡下情況類似于電針組第7 d時,而治療第21 d時能觀察到少數(shù)的巨噬細(xì)胞,說明巨噬細(xì)胞已進(jìn)入凋亡期。

2.4 成纖維細(xì)胞的組織形態(tài)學(xué)變化

成纖維細(xì)胞較大,輪廓清楚,多為突起的紡錘形或星形的扁平狀結(jié)構(gòu),其細(xì)胞核呈規(guī)則的卵圓形,核仁大而明顯。電針組在治療第1、3、7 d時間段中成纖維細(xì)胞逐漸增多,在治療第7 d時鏡下成纖維細(xì)胞數(shù)量顯著增加,聚集程度達(dá)到最大;在治療第14、21 d時間段可見病灶局部皮下中炎性細(xì)胞幾乎消失,染色較淺,成纖維細(xì)胞聚集程度逐漸降低。模型組和針刺組在治療第1、3、7、14 d時間段中成纖維細(xì)胞逐漸增多,在治療第14 d時鏡下成纖維細(xì)胞數(shù)量顯著增加,聚集程度達(dá)到最大;在治療第21 d時可見病灶局部皮下中炎性細(xì)胞幾乎消失,染色較淺,成纖維細(xì)胞聚集程度降低。

3 討論

近年來,國內(nèi)對褥瘡早期的研究僅局限于藥物治療,包括中藥治療和西藥治療兩大方面。西藥主要外用抗生素或激素治療,其不足之處在于很多患者對這些藥物過敏或易產(chǎn)生耐藥性。中醫(yī)學(xué)則認(rèn)為褥瘡由于一般病史都較長,全身進(jìn)行性營養(yǎng)消耗較明顯,辨證總體以氣血虛弱為主。通過大量文獻(xiàn)觀察發(fā)現(xiàn)中藥治療多以外用為主,或結(jié)合西藥外敷治療。在國內(nèi)有關(guān)針刺治療本病的相關(guān)研究很少,多傾向于艾灸或火針療法的研究,如張會珍等[6]、史禮[7]運(yùn)用艾灸配合皮膚針瘡周叩刺治療褥瘡,結(jié)果治愈率達(dá)到92.2%;李德君[8]在傳統(tǒng)治療方法基礎(chǔ)上局部激光照射的同時整體上輔以針灸辨證加減治療,發(fā)揮針灸調(diào)和陰陽、疏通經(jīng)絡(luò)的作用,治愈率達(dá)到93%;吳峻等[9]、閻翠蘭等[10]從最初在運(yùn)用火針治療慢性軟組織損傷中發(fā)現(xiàn)火針療法可以促進(jìn)炎癥及壞死組織的再吸收。與此同時,還做了有關(guān)火針治療褥瘡的臨床療效觀察并證明火針可以提高臨床褥瘡的治愈率并且可以縮短治療時間[11]。

炎性細(xì)胞在組織損傷修復(fù)中有不可忽視的作用,如肥大細(xì)胞可釋放炎性介質(zhì)參與機(jī)體內(nèi)多種生物功能活動。在肥大細(xì)胞的研究中發(fā)現(xiàn)炎癥產(chǎn)生的關(guān)鍵在于肥大細(xì)胞脫顆粒產(chǎn)生的多種炎性介質(zhì)參與了炎癥反應(yīng)。肥大細(xì)胞不僅是炎癥發(fā)生的主要啟動因子,而且其釋放的生物因子更能促進(jìn)炎癥進(jìn)一步加重。肥大細(xì)胞與針效的產(chǎn)生有密切關(guān)系,而細(xì)胞脫顆粒的百分率反映了炎癥反應(yīng)的程度。電針在褥瘡修復(fù)過程中的機(jī)制可能在于針刺可以更快地激活肥大細(xì)胞,引起并加快局部炎癥病灶一系列血管和免疫反應(yīng),最終達(dá)到抗炎的目的。如果說肥大細(xì)胞參與了炎癥反應(yīng)的啟動,那么巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞則負(fù)責(zé)清除“垃圾”,尤其是巨噬細(xì)胞作為體內(nèi)的“清道夫”,它們會以固定細(xì)胞或游離細(xì)胞的形式消滅侵入機(jī)體的細(xì)菌、吞噬異物顆粒,參與和促進(jìn)炎癥反應(yīng)并啟動機(jī)體免疫反應(yīng)。在機(jī)體創(chuàng)傷修復(fù)過程中,巨噬細(xì)胞分泌的多種生物活性物質(zhì)可以直接引導(dǎo)著機(jī)體修復(fù)的整個進(jìn)程。中性粒細(xì)胞具有活躍的變形運(yùn)動和吞噬功能,起重要的防御作用。其吞噬對象以細(xì)菌為主,也吞噬異物。中性粒細(xì)胞具有很強(qiáng)的趨化作用,當(dāng)炎癥發(fā)生時,它們被趨化性物質(zhì)吸引到炎癥部位。成纖維細(xì)胞具多樣性,可以緩慢地遷移。在傷口愈合過程中,成纖維細(xì)胞通過有絲分裂大量增殖,與新生毛細(xì)血管共同形成肉芽組織,填補(bǔ)傷口組織缺損。創(chuàng)傷修復(fù)是一個在時間和空間上都受到一定的細(xì)胞因子所調(diào)控的復(fù)雜生物學(xué)過程,炎性細(xì)胞的活動情況能從根本上影響創(chuàng)面的愈合時間,細(xì)胞因子能誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞向創(chuàng)傷部位補(bǔ)充(即趨化作用),并能促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖和細(xì)胞基質(zhì)的合成,促進(jìn)表皮細(xì)胞的增殖。

綜上所述,目前國內(nèi)有關(guān)針刺治療褥瘡的相關(guān)研究較少,電針治療方面更是空白。在國外,電刺激治療皮膚損傷方面頗有成效,有學(xué)者反復(fù)驗證了電刺激治療皮膚潰瘍的療效,隨之出現(xiàn)了許多成功的相關(guān)研究成果,近年來電刺激療法已經(jīng)獲得美國醫(yī)療保險和公共醫(yī)療補(bǔ)助服務(wù)中心的認(rèn)可[12],并且可以用來治療很多皮膚損傷疾病。采用傍刺手法治療褥瘡的機(jī)制在于,皮膚在損傷后,在損傷表面會形成損傷電流[13-16],并且這種損傷電流在損傷組織愈合過程中有很重要的作用,通過施加電刺激這種外源性電流可以促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的遷移、上皮細(xì)胞的再生等。本實(shí)驗通過電針后觀察局部損傷組織炎性細(xì)胞出現(xiàn)及消失的時間和聚集程度來間接證實(shí)了這種說法。

3.1 肥大細(xì)胞觀察結(jié)果討論

本實(shí)驗研究發(fā)現(xiàn),電針組、針刺組和模型組的肥大細(xì)胞數(shù)目在炎癥過程中均是先逐漸增多后逐漸減少呈曲線變化,均出現(xiàn)過峰值。電針組在治療1 d到3 d時段肥大細(xì)胞數(shù)目迅速增多,其脫顆?，F(xiàn)象最為明顯,局部炎癥反應(yīng)也比較清晰,在3 d時達(dá)到最高值,后隨著治療時間的延長,肥大細(xì)胞數(shù)目逐漸降低,說明電針組在治療開始階段即啟動了炎性反應(yīng),在治療7、14、21 d時間段上肥大細(xì)胞數(shù)目迅速減少,在治療第7 d 時,電針組中鏡下可見肥大細(xì)胞數(shù)量明顯減少,脫顆粒現(xiàn)象不明顯,提示肥大細(xì)胞進(jìn)入凋亡狀態(tài),而在其治療的第14 d時僅能觀察到少數(shù)的肥大細(xì)胞,說明炎癥正處于恢復(fù)期。模型組和針刺組在治療1、3、7 d的這一個時間段上肥大細(xì)胞數(shù)目逐漸增多,在第3、7 d時皮下結(jié)締組織有大量肥大細(xì)胞聚集并向真皮層延伸,胞漿染為深藍(lán)色,大部分肥大細(xì)胞可見脫顆?，F(xiàn)象,胞膜破潰,顆粒漏出胞膜遍布于組織間隙,細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則,并在治療7 d時達(dá)到最高值,而在隨后14 d和21 d兩個時間段上肥大細(xì)胞數(shù)目逐漸減少,脫顆粒現(xiàn)象不明顯,提示肥大細(xì)胞進(jìn)入凋亡狀態(tài),而在其治療的第21 d時僅能觀察到少數(shù)的肥大細(xì)胞,幾乎沒有脫顆?，F(xiàn)象,提示模型組和針刺組的脫顆粒現(xiàn)象峰值出現(xiàn)時間落后于電針組。以上結(jié)果表明模型組和針刺組炎性反應(yīng)的啟動時間落后于電針組,電針組大鼠在整個炎癥反應(yīng)過程中能促使肥大細(xì)胞脫顆粒現(xiàn)象提前,在各個時間點(diǎn)上肥大細(xì)胞致密度和脫顆粒程度明顯提前于模型組和針刺組。由此推測電針傍刺療法是通過提前啟動肥大細(xì)胞,縮短啟動炎性反應(yīng)的時間,加速肥大細(xì)胞脫顆粒進(jìn)程來加速褥瘡炎性反應(yīng)的發(fā)生和修復(fù)過程,減少大鼠皮膚褥瘡的面積,縮短褥瘡愈合的時間。

3.2 巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞觀察結(jié)果討論

電針組在治療第1 d時可見組織周圍間質(zhì)有巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞聚集,即炎性細(xì)胞浸潤現(xiàn)象,巨噬細(xì)胞一般體積較大,為圓形或橢圓形,染色較深,核內(nèi)的結(jié)構(gòu)看不清;中性粒細(xì)胞呈圓形,胞質(zhì)中含有大量的細(xì)小顆粒,提示局部創(chuàng)面有炎癥反應(yīng);在第3 d時炎癥病灶周圍的巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞聚集程度達(dá)到最高峰,皮下結(jié)締組織中有大量巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞聚集并向真皮層延伸,細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則,輪廓模糊,內(nèi)含有許多顆?；蚩张?在第7 d鏡下可見巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞數(shù)量明顯減少;第14 d時可見病灶局部皮下巨噬細(xì)胞幾乎消失,染色較淺。與模型組相比,電針組大鼠在整個炎癥反應(yīng)過程中的各個時間點(diǎn)上,巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞在聚集時間、聚集程度上明顯提前于模型組,針刺組次之,如模型組和針刺組在治療第1、3、7 d時間段中,巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞聚集程度逐漸增加, 第7 d時巨噬細(xì)胞浸潤現(xiàn)象最為明顯,局部炎癥反應(yīng)也比較清晰,而在治療第14 d時鏡下情況類似于電針組第7 d時,治療第21 d時能觀察到少數(shù)的巨噬細(xì)胞,說明巨噬細(xì)胞已進(jìn)入凋亡期。以上結(jié)果表明電針組在各個時間段上巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞的聚集及凋亡程度早于模型組和針刺組。由此可推測電針傍刺療法是通過加快巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的吞噬作用,使炎癥反應(yīng)的高峰期提前,以此來加速褥瘡炎性反應(yīng)的發(fā)生和修復(fù)過程。

3.3 成纖維細(xì)胞觀察結(jié)果討論

電針組在治療第1、3、7 d時間段中成纖維細(xì)胞逐漸增多,細(xì)胞較大,輪廓清楚,細(xì)胞核呈規(guī)則的卵圓形,核仁大而明顯,在治療第7 d時鏡下成纖維細(xì)胞數(shù)量顯著增加,聚集程度達(dá)到最大,提示褥瘡瘡面進(jìn)入修復(fù)期;在治療第14、21 d時間段可見病灶局部皮下中炎性細(xì)胞幾乎消失,染色較淺,成纖維細(xì)胞聚集程度逐漸降低,說明成纖維細(xì)胞在逐漸完成組織修復(fù)。模型組和針刺組在治療第1、3、7、14 d時間段中成纖維細(xì)胞逐漸增多,在治療第14 d時鏡下成纖維細(xì)胞數(shù)量顯著增加,聚集程度達(dá)到最大;在治療第21 d時可見病灶局部皮下中炎性細(xì)胞幾乎消失,染色較淺,成纖維細(xì)胞聚集程度降低,說明模型組和針刺組在組織修復(fù)過程中成纖維細(xì)胞的聚集時間明顯晚于電針組。以上結(jié)果表明,與模型組相比,電針組大鼠在整個炎癥反應(yīng)過程中的各個時間點(diǎn)上,成纖維細(xì)胞在聚集時間、聚集程度上明顯提前于模型組。由此可以推測電針傍刺療法是通過加速成纖維細(xì)胞的聚集修復(fù)來加速褥瘡炎性反應(yīng)的修復(fù)過程。

綜上所述,本實(shí)驗中褥瘡模型的選擇充分考慮壓力與摩擦力在褥瘡形成中的作用,使其更接近于臨床。實(shí)驗中電針傍刺療法能更快激活肥大細(xì)胞,引起并加快炎性反應(yīng),并能加速肥大細(xì)胞的凋亡過程,同時電刺激療法能加速中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的聚集吞噬,并使成纖維細(xì)胞聚集修復(fù)的時間提前,最終能有效縮短炎性反應(yīng)治愈時間,更早結(jié)束炎性反應(yīng)過程,加快瘡口愈合。由此可以推測電針傍刺療法治療大鼠皮膚褥瘡的主要機(jī)理可能是通過加速肥大細(xì)胞脫顆粒進(jìn)程,縮短炎性反應(yīng)啟動時間,加快巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的吞噬作用,加快成纖維細(xì)胞的聚集修復(fù)來加速褥瘡炎性反應(yīng)發(fā)生和修復(fù),降低大鼠褥瘡的面積,縮短褥瘡愈合的時間。肥大細(xì)胞脫顆粒后釋放的化學(xué)物質(zhì)是穴位局部產(chǎn)生炎性反應(yīng)的基礎(chǔ)。本實(shí)驗表明炎癥反應(yīng)終止的原因取決于結(jié)締組織中的巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞對肥大細(xì)胞顆粒的吞噬作用。而創(chuàng)傷修復(fù)是一個在時間和空間上都受到一定細(xì)胞因子調(diào)控的復(fù)雜生物學(xué)過程,炎性細(xì)胞的活動情況能從根本上影響瘡面的愈合時間。電針治療褥瘡的療效應(yīng)該是多方面、多角度的,本實(shí)驗只是初步從炎性細(xì)胞組織形態(tài)學(xué)變化方面來提示電針治療大鼠褥瘡的機(jī)理,更深層次的分子生物學(xué)機(jī)制還有待進(jìn)一步的研究探討。

值得強(qiáng)調(diào)的是,電針治療褥瘡的療效應(yīng)該是多方面、多角度的,本實(shí)驗只是初步從愈合面積及炎性細(xì)胞兩個方面來提示電針治療大鼠皮膚褥瘡的療效,更深層次的效果以及機(jī)制還有待進(jìn)一步的研究探討。

綜上所述,電針傍刺療法可以明顯減少褥瘡的面積,縮短褥瘡愈合的時間。電針療法可通過加速肥大細(xì)胞脫顆粒進(jìn)程來縮短炎癥反應(yīng)啟動時間,并能加快巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的聚集吞噬作用來促進(jìn)成纖維細(xì)胞的聚集修復(fù),迅速促進(jìn)大鼠褥瘡愈合,這可能是電針治療大鼠褥瘡的作用機(jī)制之一。

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Experimental Study of the Effect of Proximate Needling Electroacupuncture on Inflammatory Cells in Rat Bedsore

SUN Zhong-ren1, REN Xu e1, ZHANG Qin-hong1, QIU Li-po1, FANG Jian-q iao2. 1.Heilongjiang University of Traditional Chinese Medicine,Harbin 150040,China; 2.Zhejiang College of Traditional Chinese Medicine Third Hospital,Hangzhou 310000,China

ObjectivTo investigate the effects of electroacupuncture and conventional acupuncture on inflammatory cells in rat bedsore and explore the mechanism of electroacupuncture action in bedsore healing.MethodsSeventy-five male SD rats were randomly allocated to model, acupuncture and electroacupuncture groups, 25 rats each. after model making, the model group received daily basic nursing alone; the acupuncture group, acupuncture treatment in addition to daily basic nursing; the electroacupuncture group, acupuncture (same as in the acupuncture group) followed by electrostimulation with a direct current stimulator in addition to daily basic nursing. Treatment was given once daily until the day of sampling time point. In every group, the bedsore healing area was observed using the skin lesion area tracing method at 1, 3, 7, 14 and 21 days after treatment. Histological and morphological changes on the section of tissue with various inflammatory cells were also observed at different time points. Mast cells were counted at the same time.ResultsCompared with the control group, the bedsore healing area did not change significantly in the conventional acupuncture group (P＞0.05) and its mean value decreased significantly in the electroacupuncture group (P＜0.05); mast cell density and degranulation, neutrophil and macrophage congregation, and subsequent fibroblast congregation occurred earlier in the electroacupuncture group. Compared with the acupuncture group, the mean value of bedsore healing area decreased significantly, mast cell degranulation occurred significantly earlier (P＜0.05), neutrophil and macrophage congregation was accelerated and fibroblasts congregated and were repaired earlier in the electroacupuncture group. A comparison between five different time points in the three groups showed 1) the mean value of bedsore healing area changed significantly at 14 days after treatment compared with the other time points in the electroacupuncture group (P＜0.05) and changed significantly at 21 days after treatment compared with the other time points in the model and acupuncture groups (P＜0.05); 2) the number of mast cells reached the maximum value at 3 days after treatment, being significantly different from those at the other time points in the electroacupuncture group (P＜0.05) and reached the maximum value at 7 days after treatment, being significantly different from those at the other time points in the model and acupuncture groups (P＜0.05). Conclusion Proximate needling electroacupuncture can markedly decrease the bedsore area and shorten bedsore healing time. Electroacupuncturecan shorten Inflammatory reaction starting time by accelerating mast cell degranulation and quicken macrophage and neutrophil congregation and phagocytosis to promote fibroblast congregation and repair and to speed rat bedsore healing. That may be one of the mechanisms of therapeutic action of electroacupuncture on rat bedsore.

Electroacupuncture; Proximate needling; Bedsore; Inflammatory cell

R2-03

A

10.13460/j.issn.1005-0957.2014.09.0862

1005-0957(2014)09-0862-06

2014-02-12

浙江省“重中之重”學(xué)科(針灸推拿學(xué))開放基金(ZTK2010A08);黑龍江省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項目(12511508,12521Z023);黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)?？蒲谢?201106)

孫忠人(1960 - ),男,教授

方劍喬(1961 - ),男,教授,E-mail:fangjianqiao7532@163. com