丁柏英劉麗華* 謝朝輝張 杰齊潔敏賀 宇張振滿婁麗華馬建華蔡君東許新征

（1 承德市腫瘤醫(yī)院，河北 承德 067000；2 承德市中心醫(yī)院，河北 承德 067000；3 承德醫(yī)學(xué)院，河北 承德 067000；4 寬城縣中醫(yī)院，河北 寬城 067600；5 承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，河北 承德067000）

整合素α5β1與CD44V3在胃癌中的表達(dá)及臨床意義

丁柏英1劉麗華1* 謝朝輝1張 杰2齊潔敏3賀 宇2張振滿4婁麗華5馬建華2蔡君東1許新征2

（1 承德市腫瘤醫(yī)院，河北 承德 067000；2 承德市中心醫(yī)院，河北 承德 067000；3 承德醫(yī)學(xué)院，河北 承德 067000；4 寬城縣中醫(yī)院，河北 寬城 067600；5 承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，河北 承德067000）

目的本研究旨在探討整合素α5β1、CD44V3表達(dá)水平對胃癌細(xì)胞黏附、遷移、髓外浸潤過程的影響。方法采用Western blot檢測法及RT-PCR分別測量HTB-103、CRL-5822、CRL-5971及CRL-5973等不同對數(shù)生長期的胃癌細(xì)胞株整合素α5β1、CD44V3蛋白表達(dá)水平及整合素α5β1mRNA、CD44V3mRNA水平. 將不同胃癌細(xì)胞株隨機(jī)分為實驗組及對照組，實驗組加入整合素α5β1、CD44V3抗體, 對照組加入同型IgG，觀察兩組胃癌細(xì)胞與ECV304細(xì)胞系的黏附率、細(xì)胞遷移率及胃癌細(xì)胞穿過人工基質(zhì)膜的浸潤能力。結(jié)果CRL-5822、CRL-5971及CRL-5973細(xì)胞整合素α5β1mRNA相對表達(dá)量明顯高于HTB-103細(xì)胞（P<0.05）。觀察組CRL-5822、CRL-5971及CRL-5973細(xì)胞株黏附率、遷移率、及浸潤率顯著低于對照組（P<0.05），而兩組HTB-103細(xì)胞無統(tǒng)計學(xué)差異（P>0.05）。結(jié)論整合素α5β1、CD44可能參與胃癌細(xì)胞的形成、聚集、生長及浸潤的過程，其表達(dá)水平與胃癌病程進(jìn)展具有密切的關(guān)系。

整合素α5β1；CD44V3；胃癌細(xì)胞；髓外浸潤

胃癌是臨床上常見的消化道惡性腫瘤，同時也是目前世界上高發(fā)的惡性腫瘤之一，患者早期癥狀不典型難，發(fā)現(xiàn)時已屬中晚期，失去最佳手術(shù)時機(jī)，因此胃癌患者預(yù)后差，5年生存率僅為5.8%～12.4%[1]。近年隨著新型化療藥物及生物分子學(xué)的發(fā)展，使得胃癌臨床診治取得了一定的進(jìn)展，但胃癌患者預(yù)后效果仍不理想，患者病死率高，究其原因是由于胃癌早期診斷困難，當(dāng)確診時大多數(shù)已發(fā)生移，從而影響預(yù)后[2]。因此，尋找有效鑒定早期胃癌診斷的標(biāo)志物及其與胃癌侵襲、浸潤及轉(zhuǎn)移的關(guān)系對臨床提高胃癌患者治愈效果，延長胃癌患者生存期限具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 主要生化試劑及試劑盒，見表1。

表1 主要生化試劑及試劑盒

1.2 實驗步驟

1.2.1 胃癌細(xì)胞的分離及培養(yǎng)：分離方法參考Mylonas I以及Tsai SJ的方法進(jìn)行培養(yǎng)及加以改良。

1.2.2 RT-PCR法檢測胃癌細(xì)胞株α5β1、CD44V3mRNA表達(dá)。

1.2.3 Western blot檢測胃癌細(xì)胞株CD44蛋白表達(dá)。

1.2.4 胃癌細(xì)胞體外黏附、遷移、浸潤試驗：①體外黏附實驗：用酶聯(lián)免疫檢測儀測定吸光度，計算胃癌細(xì)胞黏附率。②胃癌細(xì)胞髓外遷移能力：計數(shù)下層細(xì)胞遷移數(shù)。③體外浸潤實驗：記錄穿過基質(zhì)膜細(xì)胞平均值，記錄讀數(shù)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理：采用SPSS17.0統(tǒng)計學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計量資料標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間計量資料采用t檢驗，采用Pearson相關(guān)分析對整合素 mRNA表達(dá)水平及CD44V3關(guān)系進(jìn)行分析，P<0.05被認(rèn)為有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 不同胃癌細(xì)胞株整合素α5β1、CD44V3mRNA表達(dá)水平分析：CRL-5822、CRL-5971及CRL-5973細(xì)胞整合素α5β1mRNA、CD44V3mRNA相對表達(dá)量為與HTB-103細(xì)胞整合素α5β1mRNA、CD44V3mRNA相對表達(dá)量相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），見表2和圖1。

表2 不同的胃癌細(xì)胞株整合素α5β1、CD44V3mRNA表達(dá)水平分析

表2 不同的胃癌細(xì)胞株整合素α5β1、CD44V3mRNA表達(dá)水平分析

注：與HTB-103組比，aP<0.05

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表3 不同胃癌細(xì)胞株與對照組細(xì)胞株黏附率、遷移率及浸潤情況分析

表3 不同胃癌細(xì)胞株與對照組細(xì)胞株黏附率、遷移率及浸潤情況分析

注：與對照組相比，aP<0.05

圖1 不同胃癌細(xì)胞株整合素α5β1、CD44V3mRNA表達(dá)水平分析

2.2 不同胃癌細(xì)胞株整合素α5β1、CD44V3蛋白表達(dá)水平分析：通過免疫組織化學(xué)測定可知，整合素α5β1、CD44V3蛋白在CRL-5822、CRL-5971及CRL-5973細(xì)胞核中棕黃色顆粒，而整合素α5β1、CD44V3蛋白在HTB-103內(nèi)幾乎不達(dá)。見圖2～圖5。

圖2 胃癌CRL-5822細(xì)胞株整合素α5β1免疫組化結(jié)果

圖3 胃癌CRL-5971細(xì)胞株整合素α5β1免疫組化結(jié)果

圖4 胃癌CRL-5822細(xì)胞株CD44V3表達(dá)情況

圖5 胃癌CRL-5971細(xì)胞株CD44V3表達(dá)情況

2.3 觀察組與對照組不同白細(xì)胞株黏附率、遷移率及浸潤率分析：觀察組CRL-5822、CRL-5971及CRL-5973細(xì)胞株黏附率、遷移率及浸潤率顯著低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），而兩組HTB-103細(xì)胞黏附率、遷移率及浸潤率無統(tǒng)計學(xué)差異（P>0.05），見表3。

3 討 論

3.1 整合素α5β1與胃癌細(xì)胞黏附、轉(zhuǎn)移及浸潤的關(guān)系：整合素是一類重要的細(xì)胞表面受體，其作用是介導(dǎo)細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）與細(xì)胞黏附。腫瘤的發(fā)生是細(xì)胞信號系統(tǒng)缺陷性疾病，整合素作為信號的傳導(dǎo)者目前已被證實其表達(dá)水平的下降與腫瘤的轉(zhuǎn)移及細(xì)胞轉(zhuǎn)化具有密切的關(guān)系[3]。近年不少研究證實[4]在癌細(xì)胞內(nèi)不同的整合素其表達(dá)水平存在一定的差異，這提示整合素可通過誘導(dǎo)基因或傳遞特定信號基因表達(dá)來調(diào)控腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)化、生長、侵襲及調(diào)亡等一系列生理變化過程。整合素在腫瘤中的表達(dá)主要表現(xiàn)為三種變化形式，整合素的改變及表達(dá)水平的減少或增加[5]。在正常組織或惡性腫瘤中整合素的表述水平存在一定的差異，在胃癌轉(zhuǎn)移細(xì)胞中可發(fā)現(xiàn)整合素α5、α6持續(xù)高表達(dá)。牛曉敏等[6]研究指出，整合素可與ECM分子黏附連接并在細(xì)胞外基質(zhì)上鋪展，而細(xì)胞上的整合素在細(xì)胞黏附面上分布不均勻，且呈斑點樣分布。腫瘤的異常分化是由于細(xì)胞異常增殖引起的，機(jī)體中細(xì)胞增殖不僅由細(xì)胞核有絲分裂控制，同時胞外的一些物質(zhì)如纖維蛋白也可參與細(xì)胞有絲分裂過程，細(xì)胞是通過跨膜受體上的整合素成分黏附其上。

本研究中免疫組化法結(jié)果均顯示，CRL-5822、CRL-5971及CRL-5973細(xì)胞整合素α5β1蛋白表達(dá)量均高于HTB-103，在HTB-103細(xì)胞中表達(dá)量極低。經(jīng)PCR進(jìn)一步證實，整合素α5β1在HTB-103細(xì)胞中的表達(dá)非常微小甚至不表達(dá)。黏附實驗顯示，觀察組整合素α5β1單抗經(jīng)預(yù)處理后CRL-5822、CRL-5971及CRL-5973細(xì)胞株黏附率顯著低于對照組，且CRL-5822下降水平較為顯著。CRL-5822、CRL-5971及CRL-5973細(xì)胞遷移及髓外浸潤能力顯著高于HTB-103，從而推斷出CD44可參與胃癌細(xì)胞基質(zhì)外黏附、遷移、浸潤過程，與胃癌病情進(jìn)展關(guān)系密切。

3.2 CD44V3與胃癌細(xì)胞黏附、轉(zhuǎn)移及浸潤的關(guān)系：黏附分子CD44屬于細(xì)胞表面跨膜糖蛋白受體，其可與透明質(zhì)酸（HA）結(jié)合生成高分子黏多糖，介導(dǎo)淋巴細(xì)胞歸巢、細(xì)胞外基質(zhì)黏附等多種生理病理反應(yīng)。近年縱多的研究表明[7]，黏附分子CD44高度表達(dá)與腫瘤生成、轉(zhuǎn)移過程關(guān)系密切。Schlaepfer[8]以CD44為靶點分子，通過阻斷CD44與HA結(jié)合從而抑制腫瘤生成及轉(zhuǎn)移，起到靶向治療的作用。Guibso[9]等通過運用CD44單克隆抗體、CD44V10受體蛋白及CD44s蛋白阻斷肺癌小鼠細(xì)胞中CD44與HA的結(jié)合，結(jié)果顯示，肺癌小鼠不經(jīng)任何治療的情況下，其CD44v10及受體蛋白在肺部的轉(zhuǎn)移量分別下降了60%及70%。Hayashi[10]等發(fā)現(xiàn)急性胃癌患者血清CD44水平顯著高于正常體檢者，其患者放化療后血清CD44水平居高不下者較血清CD44正常者更容易出現(xiàn)復(fù)發(fā)，從而推測胃癌病情進(jìn)展可能與血清CD44水平增高有關(guān)。PeHegrim[11]等指出肺癌患者淋巴結(jié)外轉(zhuǎn)移、臨床分期較高的患者其血清CD44水平較高。Kim[12]等發(fā)現(xiàn)急性胃癌Ⅱ～Ⅲ期患者血清CD44水平顯著高于0～Ⅰ期患者。從以上研究可推斷出，CD44表達(dá)水平可作為某些腫瘤病情發(fā)展的預(yù)測指標(biāo)，通過測定血清CD44可有效評價腫瘤惡性程度及預(yù)后效果。

本研究中免疫組化法結(jié)果均顯示，CRL-5822、CRL-5971及CRL-5973細(xì)胞CD44蛋白表達(dá)量均高于HTB-103，CD44在HTB-103細(xì)胞中表達(dá)量極低。經(jīng)PCR進(jìn)一步證實，CD44在HTB-103細(xì)胞中的表達(dá)非常微小甚至不表達(dá)。黏附實驗顯示，觀察組CD44單抗經(jīng)預(yù)處理后CRL-5822、CRL-5971及CRL-5973細(xì)胞株黏附率顯著低于對照組，且CRL-5822下降水平較為顯著。CRL-5822、CRL-5971及CRL-5973細(xì)胞遷移及髓外浸潤能力顯著高于HTB-103，從而推斷出CD44可參與胃癌細(xì)胞基質(zhì)外黏附、遷移、浸潤過程，與胃癌病情進(jìn)展關(guān)系密切。目前關(guān)于CD44在胃癌中髓外浸潤的機(jī)制還有待進(jìn)一步研究，但相關(guān)研究指出，CD44參與腫瘤的形成、生長、轉(zhuǎn)移及髓外浸潤與基質(zhì)金屬蛋白酶活性有關(guān)。

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The Expression and Clinical Significance of Integrin α5β1 and CD44V3 in Gastric Cancer

DING Bo-ying1, LIU Li-hua1*, XIE Zhao-hui1, ZHANG Jie2, QI Jie-min3, HE Yu2, ZHANG Zhen-man4, LOU Li-hua5, MA Jian-hua2, CAI Jun-dong1, XU Xin-zheng2
(1 Chengde Tumor Hospital, Chengde 067000, China; 2 Chengde Central Hospital, Chengde 067000, China; 3 Chengde Medical College, Chengde 067000, China; 4 Kuangcheng TCM Hospital, Kuancheng 067600, China; 5 Affiliated Hospital of Chengde Medical College, Chengde 067000, China)

ObjectivesThis study aimed to investigate the integrin α5β1, CD44V3expression levels of gastric cancer cell adhesion, migration , the impact of extramedullary infiltration process and its relationship with clinical features of gastric cancer.MethodsUsing Western blot and RT-PCR assays were used to measure HTB-103, CRL-5822, CRL-5971 and CRL-5973 , such as different logarithmic phase of gastric cancer cell lines integrin α5β1, CD44V3protein levels and integrin α5β1mRNA, CD44V3mRNA level. different gastric cancer cell lines were randomly divided into experimental group and control group, the experimental group was added integrin α5β1, CD44V3antibody isotype control group added IgG, were observed in gastric cancer cells and ECV304 adhesion rate cell lines , cell mobility and the ability to artificial gastric cancer cell invasion through the matrix of the film.ResultsCRL-5822, CRL-5971 and CRL-5973 cells relative expression of integrin α5β1mRNA were significantly higher than the HTB-103 cells (P <0.05). observation group CRL-5822, CRL-5971 and CRL-5973 cell line adhesion rate mobility, and infiltration rate significantly lower than the control group adhesion rate(P<0.05), while the two HTB-103 cell adhesion rate , migration rate and infiltration rate was no significant difference (P> 0.05).ConclusionsIntegrin α5β1, CD44may be involved in the formation of gastric cancer cell aggregation, the process of growth and invasion , and its expression level and progression of gastric cancer have a close relationship.

Integrin α5β1; CD44V3; Gastric cancer cells; Extramedullary infiltration

R735.1

B

1671-8194（2014）34-0187-03

*通訊作者：E-mail： 450309836@qq.com