張 蕾，陳 璐，李蒙蒙，金王東，王飄逸，單樂天*

（1. 浙江科技學(xué)院 生物與化學(xué)工程學(xué)院，浙江 杭州 310023；2. 浙江省農(nóng)產(chǎn)品化學(xué)與生物加工技術(shù)重點實驗室，浙江 杭州 310023；3. 浙江中醫(yī)藥大學(xué)，浙江 杭州 310053）

惡性腫瘤的發(fā)病率和死亡率日益升高，嚴(yán)重威脅人類的生命健康，在我國城鄉(xiāng)居民主要死亡原因中已經(jīng)高居第一位[1]。而在惡性腫瘤中，黑素瘤作為一種惡性程度相對較高的腫瘤近年來的發(fā)病率呈現(xiàn)增長的態(tài)勢。黑色素瘤又名惡性黑瘤，多發(fā)于皮膚，也有起源于眼、鼻腔等處，早起可發(fā)生轉(zhuǎn)移，一般多見于肺和腦。在治療方面以手術(shù)切除為主要的治療方法，配合化療、放療和免疫治療，但是都存在較大的不良反應(yīng)。因此，采用副作用相對小并且療效高的生物治療方法受到臨床研究者的廣泛重視。

近年研究發(fā)現(xiàn)，許多中藥單體或復(fù)方能夠發(fā)揮抗癌抑癌的功效[2]。丹參是常用的活血化瘀中藥之一，在臨床上長期被用于心腦血管疾病的治療，近年來在抗腫瘤活性方面成為研究的熱點，但其具體作用機(jī)制仍未完全闡明。丹參為雙子葉唇形科鼠尾草屬植物丹參的干燥根及根莖，其主要功效為活血調(diào)經(jīng)、祛瘀止痛、涼血消癰、清心除煩、養(yǎng)血安神。已有研究表明丹參對心血管和消化系統(tǒng)均有作用，例如對腦損傷和肺損傷的保護(hù)，抗高血壓以及調(diào)節(jié)血脂等[3]。Zheng等[4]采用丹參酒精提取液對人結(jié)腸癌細(xì)胞（HT-29）、直腸癌細(xì)胞（HRT-18）及肝癌細(xì)胞（HepG2）進(jìn)行體外實驗結(jié)果表明, 對上述癌細(xì)胞均有抑制作用。已有報道表明[5～7]，在這些脂溶性成分中，丹參酮IIA等有確切的抗腫瘤效果，表現(xiàn)在對腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞周期，細(xì)胞增殖和凋亡方面。但是對于丹參酮I的抗腫瘤作用的研究報道較少，為了進(jìn)一步研究，本實驗將以B16黑色素細(xì)胞為載體，對丹參酮I的抗腫瘤作用進(jìn)行實驗研究。

1 實驗材料

1.1 藥物及試劑

丹參酮I（純度90%）南京澤朗醫(yī)藥公司；胎牛血清（賽默飛世爾生物化學(xué)制品有限公司，批號NWJ0473）；胰蛋白酶-EDTA消化液（Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd.）；改良型的RPMI1640培養(yǎng)液（賽默飛世爾生物化學(xué)制品有限公司，批號NYH095 1）；磷酸鹽緩沖液（賽默飛世爾生物化學(xué)制品有限公司，批號NYA0786），MTT，DMSO購自北京拜爾迪生物技術(shù)公司；細(xì)胞凋亡檢測試劑盒，青鏈霉素混合液（Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd.）。

1.2 細(xì)胞株

黑色素瘤細(xì)胞（B16細(xì)胞），購自北京中科院細(xì)胞資源庫。

1.3 實驗儀器

SW-CJ-1F層流超凈工作臺（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）；AXiovert200熒光倒置顯微鏡，多功能酶標(biāo)儀（Thermo Scientific，USA）；超低溫冰箱（Thermo, USA）；DK-S12型恒溫水浴鍋（上海森信實驗儀器有限公司）；Thermo Scientific CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（Thermo, USA）；MM-2(ZW-A)微量振蕩器（金壇市梅香儀器有限公司）。

2 實驗方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)液的制備

將使用前的1640培養(yǎng)液加入青鏈霉素混合液（青霉素10 000 U/mL和鏈霉素10 000 U/mL），并且使青鏈霉素混合液的濃度占培養(yǎng)基的1%，再取過膜后的胎牛血清加入到先前配好的1640培養(yǎng)液中，使血清的濃度占總濃度的10%，最后配成適合小鼠黑色素瘤B16細(xì)胞生長的培養(yǎng)液。

2.2 細(xì)胞的培養(yǎng)和傳代

從-80℃冰箱取出凍存的B16細(xì)胞迅速投入37℃恒溫水浴鍋中，搖晃使其盡快解凍后置于10 mL離心管，加入適量培養(yǎng)液，重懸細(xì)胞，棄上清，加培養(yǎng)液混勻。將B16細(xì)胞培養(yǎng)在含10%FBS、1%青鏈霉素的1640培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO2及相對飽和濕度的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀察細(xì)胞的貼壁狀況，每隔2 ～ 3 d視情況更換培養(yǎng)液。待細(xì)胞貼壁并且細(xì)胞密度達(dá)到瓶底面積的80% ～ 90%后進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

傳代前先棄去原來的培養(yǎng)液，加入2 ～ 3 mL的PBS溶液，輕輕搖晃漂洗細(xì)胞后傾去。然后加入適量0.25%胰蛋白酶，室溫下（或37℃）消化2 ～ 3 min后，用吸管吸出消化液。接著在培養(yǎng)瓶中加入3 mL培養(yǎng)液，終止消化。用吸管反復(fù)吹打瓶壁上的細(xì)胞層，輕輕吹打混勻，制成單細(xì)胞懸液，按1：2或1：3分配，接種到2 ～ 3個培養(yǎng)瓶內(nèi)，再向各瓶補加培養(yǎng)液4 mL繼續(xù)培養(yǎng)。每隔2 ～ 3 d 換培養(yǎng)液，傳代之第二代后，去對數(shù)生長期的細(xì)胞用于實驗。

2.3 藥物配制

稱取800 μg丹參酮I，取適量的DMSO溶解，加入含有10%的胎牛血清的1640培養(yǎng)液進(jìn)行稀釋，并把溶液分為3個濃度：5、4、3 μg/mL為對照組。

2.4 細(xì)胞顯微觀測

將B16細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板中，密度控制在1×105/孔左右，培養(yǎng)24 h等細(xì)胞貼壁后，置于倒置顯微鏡下觀察B16細(xì)胞形態(tài)學(xué)的變化并拍照；并與0 μg/mL丹參酮I和3 μg/mL丹參酮I的培養(yǎng)基培養(yǎng)同等時間下的B16細(xì)胞形態(tài)進(jìn)行對照比較。

2.5 MTT法檢測丹參酮I對B16細(xì)胞的抑制作用

取處于對數(shù)生長期的B16細(xì)胞，用 0.25%胰蛋白酶消化回收制成單細(xì)胞懸液，統(tǒng)計細(xì)胞數(shù)量，將細(xì)胞密度調(diào)整到（4 ～ 5）×103/mL接種到96孔板，用不含胎牛血清的培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h后換含藥的培養(yǎng)液?？瞻讓φ战M給予等體積PBS；實驗組分加入不同濃度的丹參酮I，其濃度分別為5、4、3 μg/mL，陰性對照組為含0 μg/mL丹參酮I，每個濃度設(shè)5個復(fù)孔。分別設(shè)24、48、72 h 3個時間點培養(yǎng)后，棄去培養(yǎng)液，加入事先配好的5 g/L的MTT液（20 μL/孔），避光在37℃、5%CO2及相對飽和濕度的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h后，吸去上清液，加入DMSO 150 μL/孔，之后立即用微型震蕩器避光震蕩5 ～ 10 min，使DMSO完全混勻溶解結(jié)晶，之后在酶標(biāo)儀上用490 nm測其吸光度（A），實驗重復(fù)3次。按以下公式計算抑制率。

2.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期變化

將5 μg/mL丹參酮I分別作用24、48、72 h 3個時間點后的B16黑色素瘤細(xì)胞用胰酶消化收集濃度，再用PBS洗滌2次，用500 uL PBS重懸細(xì)胞，將懸液逐滴慢慢加入到預(yù)先冷卻的4.5 mL70%乙醇中，置-20℃下過夜。取出離心棄上清，如殘留在壁上則再次離心（500 r/min，2 ～ 3 min），用試劑盒中的Reagent B清洗2次（1 mL/次），重復(fù)上述操作后收集細(xì)胞。取試劑盒中的Reagent A 1 mL加入到細(xì)胞中，放入37℃水浴中水浴15 min后，用流式細(xì)胞儀檢測。

2.7 統(tǒng)計學(xué)處理

采用DPS7.50軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，以P ＜ 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果分析

3.1 丹參酮I對B16細(xì)胞形態(tài)的影響

在倒置顯微鏡下觀察B16黑色素腫瘤細(xì)胞的生長情況及細(xì)胞形態(tài)，可以發(fā)現(xiàn)給藥組的腫瘤細(xì)胞數(shù)量明顯的減少，細(xì)胞變小，細(xì)胞邊緣模糊，貼壁率低。而對照組的不含丹參酮 I的細(xì)胞生長旺盛，貼壁率高，細(xì)胞形態(tài)飽滿無明顯改變（圖1）。

圖1 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察（×200）Figure 1 Morphology of cells

3.2 丹參酮I對B16細(xì)胞的抑制作用

用MTT法檢測后發(fā)現(xiàn)不同濃度的丹參酮I分別給藥24、48、72 h后，對B16細(xì)胞的生長呈明顯抑制作用。隨藥物作用時間延長，細(xì)胞生長抑制率逐漸升高，5 μg/mL的丹參酮I引起的細(xì)胞生長抑制率明顯高于其他濃度

表1 不同濃度的丹參酮I對B16細(xì)胞的生長抑制作用Table 1 Effect of different concentration of Tanshinone I on B16 melanoma cells

圖2 不同濃度丹參酮I作用B16細(xì)胞的周期比較Figure 2 Comparisons on B16 cell cycles treated by different concentrations of Tanshinone I

（P ＜ 0.05）。由IC50值發(fā)現(xiàn)隨著作用時間的延長，抑制細(xì)胞增長一半時的丹參酮I濃度在明顯減少。由此表明丹參酮I的細(xì)胞抑制率與藥物濃度及作用時間密切相關(guān)（表1）。

3.3 丹參酮I對B16細(xì)胞周期的影響

B16細(xì)胞經(jīng)給藥組（5 μg/mL丹參酮I作用72 h）和空白對照組（0 μg/mL丹參酮I作用72 h）處理，PI染色后使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行監(jiān)測分析（圖2）。

細(xì)胞的分化生長分為幾個時期，G0期是細(xì)胞休眠期，而G1期是從有絲分裂到DNA復(fù)制前的一段時期，又稱合成前期，S期是DNA合成期。通過與空白對照組比較可以發(fā)現(xiàn)在G1期給藥組的細(xì)胞略微比空白組多，但是在S期給藥組的細(xì)胞數(shù)下降且小于空白組（見表2，圖3）。結(jié)果表明丹參酮I能使B16細(xì)胞周期阻滯于分裂期，使其不能進(jìn)入S期。

圖3 丹參酮I作用B16細(xì)胞72 h后細(xì)胞周期的變化Figure 3 Changes of B16 cell cycles 72 hours after treated by Tanshinone I

4 結(jié)論與討論

丹參作為一味中藥被廣泛的應(yīng)用在各種疾病的臨床治療，并且在抗腫瘤方面也有很大的作用。有研究發(fā)現(xiàn)丹參對人的肺癌、卵巢癌、黑色素瘤、結(jié)腸癌具有細(xì)胞毒作用，這些腫瘤細(xì)胞在經(jīng)過從丹參根部提取的有效成分的培養(yǎng)后，細(xì)胞系的增殖均顯著受到抑制[8]。其中袁淑蘭等[9]研究發(fā)現(xiàn)：丹參酮IIA對各種腫瘤（包括白血病、軟骨瘤、胃癌、胰腺癌、鼻咽癌）均有不同程度的療效。而丹參酮I為丹參抗腫瘤有效成分之一，目前的抗腫瘤機(jī)制的研究還處于探索階段。有研究報告指出，丹參酮I在體外體內(nèi)試驗表現(xiàn)出抗腫瘤活性，其作用機(jī)制可能通過白介素-8，Ras-mitogen-activated蛋白激酶和Rac1信號傳導(dǎo)途徑[10]。在另一份有關(guān)丹參酮I抗腫瘤的報道中，學(xué)者采用HepG2細(xì)胞進(jìn)行研究，實驗表明丹參酮I能抑制體外培養(yǎng)的癌細(xì)胞，并導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[11]。

本次實驗主要采用小鼠B16黑色素瘤細(xì)胞，有研究報道，丹參具有抗黑色素瘤轉(zhuǎn)移的效應(yīng)，這種效應(yīng)可能是在丹參抑制瘤細(xì)胞的侵襲性和運動能力、加強(qiáng)粘附能力的共同作用下表現(xiàn)出來[12]。實驗結(jié)果表明，不同濃度的丹參酮I對B16細(xì)胞的生長起到抑制作用，抑制的效果隨著作用的時間和藥物濃度的增加而增強(qiáng)。從倒置顯微鏡下觀察，不含丹參酮I培養(yǎng)液培養(yǎng)的B16細(xì)胞生長旺盛，存活率高，而經(jīng)丹參酮I培養(yǎng)的細(xì)胞生長受阻，開始出現(xiàn)凋亡的現(xiàn)象。有報道指出，丹參酮I能抑制HepG2細(xì)胞的增殖；通過觀察HepG2細(xì)胞的形態(tài)觀察到癌細(xì)胞生長被抑制，從HepG2細(xì)胞周期測定結(jié)果顯示，丹參酮I先將細(xì)胞周期阻滯于G0/G1期，然后誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[13]。Bax和Bcl-2是一對凋亡相關(guān)調(diào)控基因，Bax主要通過與其家族Bcl-2形成二聚體而發(fā)生作用。當(dāng)Bcl-2表達(dá)較高時，Bcl-2和Bax形成異源二聚體而抑制凋亡；當(dāng)Bax表達(dá)較高時，Bax之間形成同源二聚體而促進(jìn)凋亡。從本次試驗流式細(xì)胞檢測表明，丹參酮I對B16細(xì)胞周期產(chǎn)生了影響，阻滯了細(xì)胞周期的分裂期，從而抑制了細(xì)胞的生長，使細(xì)胞加入S期的比例明顯減少，進(jìn)一步促使細(xì)胞的凋亡，從而達(dá)到抗腫瘤的效果。

丹參酮I作為抗腫瘤的有效成分，在對抗小鼠B16黑色素瘤細(xì)胞的試驗中表現(xiàn)出一定的抗腫瘤效果，尤其是在阻滯腫瘤細(xì)胞的生長和促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡方面，并且作用效果隨著給藥濃度和給藥時間的延長而增強(qiáng)。由此可見丹參酮I在抗腫瘤方面具有很大的實驗研究的潛質(zhì)，為臨床抗腫瘤藥物的研發(fā)奠定了基礎(chǔ)。

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