蘇志芳等

摘要[目的]構(gòu)建紫花苜蓿MsCOL1基因植物的表達(dá)載體。[方法]根據(jù)紫花苜蓿CONSTANS類似基因MsCOL1基因（登錄號：DQ661682）序列，設(shè)計含有酶切位點的一對特異性引物，以紫花苜蓿cDNA為模板，獲得MsCOL1基因完整編碼區(qū)DNA序列，并將目的片段插入表達(dá)載體pBI121的相應(yīng)位置，構(gòu)建植物表達(dá)載體35S∷MsCOL1，再利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)方法將35S∷MsCOL1轉(zhuǎn)化到擬南芥中。[結(jié)果]分析測序結(jié)果顯示，所獲得克隆為插入目的片段的陽性克隆。經(jīng)RTPCR 檢測，證明轉(zhuǎn)基因植株中MsCOL1基因能夠順利表達(dá)。[結(jié)論]該方法成功構(gòu)建植物表達(dá)載體35S∷MsCOL1，并獲得了轉(zhuǎn)基因擬南芥植株。

關(guān)鍵詞紫花苜蓿；擬南芥；轉(zhuǎn)基因；MsCOL1

中圖分類號S541+.1文獻標(biāo)識碼A文章編號0517-6611（2014）06-01610-02

Abstract[Objective] To construct plant expression vector of MsCOL1 gene from alfalfa. [Method] Based on the sequence of alfalfa CONSTANSLike 1 （MsCOL1） gene （Access No.： DQ661682）， two pairs of specific primers containing different enzyme sites were designed. With the template of fulllength cDNA， the coding domain sequence of MsCOL1 was obtained， which was inserted into the restrict sites of expression vector pBI121， resulting plant expression vector 35S：：MsCOL1. Mediated by Agrobacterium tumefaciens， 35S：：MsCOL1 was transformed into Arabidopsis thaliana. [Result] PCR testing showed that 15 transgenic plants were obtained. [Conclusion] These results indicated that the plant expression vector 35S：：MsCOL1 was constructed and transgenic Arabidopsis plants with MsCOL1 gene were obtained successfully.

Key wordsAlfalfa； Arabidopsis thaliana； Transgene； MsCOL1

有關(guān)植物開花時間的分子生物學(xué)研究，在模式植物擬南芥上已經(jīng)進行得相對全面、深入。在調(diào)控擬南芥開花時間的光周期途徑中，CONSTANS（CO）基因的表達(dá)控制擬南芥感知日照時間的長短，在連接光信號與生物信號過程中起關(guān)鍵性作用，該基因編碼一個含有鋅指結(jié)構(gòu)的核蛋白[1]。當(dāng)植物受到長時間光照時，CO基因的mRNA表達(dá)量增加[2]。CO基因是FT基因[1]和SOC1基因[3]的上游基因，其轉(zhuǎn)錄因子能促進植物開花。在擬南芥開花時間有關(guān)基因調(diào)控研究中，CO基因突變體能使開花時間延遲，通過調(diào)節(jié)增加CO基因的表達(dá)，可以使FT基因的表達(dá)量提高，使植物開花行為提前發(fā)生[1]。但是在CO基因的同源基因COL的表達(dá)模式中，功能有所差異。過表達(dá)COL1基因只能使其晝夜節(jié)律明顯縮短，但對植物開花時間沒有產(chǎn)生干擾；COL2基因的表達(dá)量對植物開花時間沒有干擾[4]；COL3基因的表產(chǎn)物對紅色波長信號敏感，并且能使根部細(xì)胞生長加快[6]。COL9基因的超量表達(dá)能使植物延遲開花[5]。相關(guān)研究結(jié)果表明，通過轉(zhuǎn)基因方法將擬南芥CO基因?qū)腭R鈴薯中進行過表達(dá)，使馬鈴薯的帶花現(xiàn)象延遲[7]。此外，水稻中的一個CO的同源基因OsCO3在水稻中過表達(dá)時能導(dǎo)致水稻開花推遲[8]。

在植物生長發(fā)育中，開花時間是一個非常重要的生理事件。開花時間受到多種基因調(diào)控。已克隆的與開花時間相關(guān)基因僅在擬南芥、水稻等少數(shù)幾種植物中成功獲得。通過對這些基因進行分析，種間的CO基因存在較高的保守性，但其在作用機理上卻存在較大差異。此外，由于CO基因在植物中屬于一個包含多拷貝的基因家族，這個家族中其他拷貝的基因是否與調(diào)控開花時間有關(guān)還不是很清楚，故仍需深入研究。為了揭示植物開花時間的調(diào)控基因網(wǎng)絡(luò)，需要對開花時間相關(guān)基因的作用機理及互作模式進行深入研究。

轉(zhuǎn)基因技術(shù)是通過構(gòu)建使目標(biāo)基因過量表達(dá)的DNA載體，將其轉(zhuǎn)化到植物體內(nèi)實現(xiàn)基因功能。筆者將構(gòu)建的紫花苜蓿MsCOL1基因過量表達(dá)載體，應(yīng)用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法獲得擬南芥轉(zhuǎn)基因植株，以期為研究該基因的功能奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株與質(zhì)粒。大腸桿菌菌株為E.coli DH5α，購自上海申能博彩生物科技有限公司；克隆載體 pMD19T與植物表達(dá)載體pBI121，由內(nèi)蒙古巴彥淖爾市農(nóng)科院畜牧所惠贈；農(nóng)桿菌菌株GV3101，實驗室保存。

1.1.2主要試劑。限制性內(nèi)切酶、T4DNA連接酶及DNA回收試劑盒，均購自TaKaRa公司；DL2000 DNA Marker和 Tap DNA聚合酶，購自北京天根生物科技有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純，市售。

1.2.3MsCOL1基因表達(dá)載體構(gòu)建及鑒定。利用質(zhì)粒小提試劑盒，對含有正確MsCOL1基因序列的大腸桿菌，提取質(zhì)粒，使用XbaI和BamHI雙酶切，經(jīng)凝膠電泳檢測分別回收目的片段后，使用T4連接酶16 ℃連接6 h后，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH 5α，在含有50 mg/L卡納霉素的LB固體培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)，挑取單克隆菌落，進行PCR鑒定，以CO1f和CO1r為引物；然后將含有目的條帶的菌液送至北京三博遠(yuǎn)志測序鑒定。構(gòu)建的植物表達(dá)載體命名為35S∷MsCOL1。

1.2.4農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化擬南芥及其鑒定。提取35S∷MsCOL1質(zhì)粒并純化，用CaCl2凍融法將重組子導(dǎo)入農(nóng)桿菌GV3101中，菌液PCR篩選陽性克隆。利用花序浸泡法，對處于花蕾期的野生型擬南芥進行農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化，具體步驟為：將已經(jīng)長出腋生花序的擬南芥植株在含有pBINCED4的農(nóng)桿菌菌液浸泡約5 min，罩上塑料袋，在恒溫箱中放置，暗培養(yǎng)24 h，一周后再次浸入農(nóng)桿菌懸浮液浸染，溫室中待擬南芥生長成熟。收集擬南芥種子，在無菌條件下，將擬南芥種子用70%酒精浸泡10 min后，用蒸餾水清洗，然后均勻撒在含有50 mg/L卡那霉素1/2Ms培養(yǎng)基上。15 d后，選取正常生長的擬南芥幼苗，轉(zhuǎn)移到土中，繼續(xù)生長。

1.2.5再生植株檢測。采用CTAB法提取抗性苗基因組DNA，以CO1f和CO1r為引物，以基因組DNA為模板進行PCR檢測。

2結(jié)果與分析

2.1紫花苜蓿MsCOL1基因植物表達(dá)載體構(gòu)建及鑒定以紫花苜蓿第一鏈cDNA為模板，以引物CO1f和CO1r進行PCR擴增，瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產(chǎn)物，得到的片段大小與預(yù)期結(jié)果一致（圖1）。PCR產(chǎn)物分別用瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收后，與克隆載體pMD19T載體連接。轉(zhuǎn)化后，挑取陽性克隆鑒定并測序。分析測序結(jié)果顯示，所獲得克隆為插入目的片段的陽性克隆。

具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的RNAi載體pARTSA使紫花苜蓿的MsCOL1基因表達(dá)量有所下降[9]。張威威等構(gòu)建了銀杏pCAMBIA1304GbCOab表達(dá)載體，用轉(zhuǎn)基因來研究CO基因功能是一種常用的方法，該方法已經(jīng)在很多實驗中得到應(yīng)用[10]。

試驗為了構(gòu)建MsCOL1基因超表達(dá)載體，通過PCR擴增的方式在目的基因開放閱讀框兩端分別引入XbaⅠ和BamHⅠ酶切位點，保證了連接方向的準(zhǔn)確性。將分離到的基因構(gòu)建表達(dá)載體轉(zhuǎn)入擬南芥中進行過量表達(dá)，得到成功轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因苗，進一步研究了MsCOL1基因及NCED4基因的功能。試驗采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法轉(zhuǎn)化擬南芥，并通過PCR反應(yīng)與未轉(zhuǎn)化的植株對比驗證，結(jié)果顯示所轉(zhuǎn)化的4株全部為陽

性，證實目的基因已轉(zhuǎn)入擬南芥基因組中。研究將構(gòu)建的MsCOL1基因過量表達(dá)載體導(dǎo)入擬南芥中，得到轉(zhuǎn)基因植株，對該基因功能的研究具有重要的價值。

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