董姻然　陳湘寧　常希光等

摘要 [目的]為了獲得質(zhì)量較好的芹菜莖的總RNA，為后續(xù)分子生物學(xué)試驗提供基礎(chǔ)。[方法]試驗對1種RNA提取方法（Trizol法）和2種RNA提取試劑盒（RNA prep Pure Plant Kit法、RNA simple Total RNA Kit法）方法進(jìn)行比較研究。[結(jié)果]RNA prepPure Plant Kit方法得率低，且OD260/OD280值低于1.8，Trizol法OD260/OD230高于2.0，且得率低于RNA simple Total RNA kit法。只有RNA simple Total RNA kit法提取的RNA質(zhì)量最好，得率最高。[結(jié)論]與Trizol法和RNA prep Pure Plant Kit法相比，RNA simple Total RNA Kit法提取的芹菜莖總RNA得率高，完整性好，凝膠電泳泳道無雜質(zhì)，可以滿足半定量RTPCR的試驗需要。

關(guān)鍵詞 芹菜；總RNA提?。籖NA simple Total RNA Kit法

中圖分類號 S636.3 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號 0517-6611（2014）08-02273-03

The Comparison of Several Kinds of Methods for Extracting Total RNA from the Stalk of Celery

DONG Yinran， CHEN Xiangning et al

（Department of Food Science and Engineering， Beijing University of Agriculture， Beijing 102206； Beijing Key Laboratory of Agricultural Product Detection and Control of Spoilage Organisms and Pesticide Residue， Beijing 102206）

Abstract [Objective] In order to obtain better quality total RNA in the stalk of celery and lay the foundation for subsequent molecular biology experiments. [Method] One RNA extraction method（Trizol method） and two RNA extraction kits （RNA prep Pure Plant Kit method， RNA simple Total RNA Kit method） were compared. [Result] The yield of RNA prepPure Plant Kit is low， OD260/OD280 value is lower than 1.8， OD260/OD230 of Trizol method is higher than 2.0， the yield is lower than RNA simple Total RNA kit method. RNA extracted by RNA simple Total RNA kit has the best quality and the highest yield. [Conclusion] The results showed that the Trizol method was better than two RNA extraction kit method， the total RNA isolated with Trizol method had high integrity， high yield， good stability， and no pollution in the gel electrophoresis track. And then could meet the needs of the semiquantitative RTPCR test.

Key words Celery； Total RNA extraction； RNA simple Total RNA Kit method

芹菜在我國廣泛種植，具有清熱解毒、宣肺利尿、降低血壓和血脂等多種食療功效[1]，是一種低熱量蔬菜，每100 g只有83.68 kJ熱量，卻含有豐富的維生素C（32.0 mg）、維生素A （0.207 mg）、鉀（280.00 mg）等營養(yǎng)物質(zhì)[2]，深受人們的喜愛。但是芹菜在采后貯藏運輸過程中極易出現(xiàn)失水、黃化、萎蔫、質(zhì)地變劣和腐爛等現(xiàn)象，造成芹菜大量浪費。隨著生活水平的提高，人們對這種健康綠色蔬菜的需求量也越來越大，因此開展關(guān)于延長芹菜儲藏期的研究已具有重大意義。

目前，學(xué)者們對其他水果蔬菜從分子生物學(xué)角度研究其采后保鮮機(jī)制為芹菜的保鮮研究奠定了基礎(chǔ)。趙宏亮研究香蕉采后生理變化和分子水平上的變化結(jié)合起來，從分子水平上研究香蕉采后相關(guān)基因的表達(dá)變化[3]。羅志嬌從分子生物學(xué)角度克隆雙孢菇采后褐變相關(guān)基因，為實現(xiàn)蘑菇抗褐變定向育種的奠定了基礎(chǔ)，延長了雙孢菇采后的儲藏期[4]。進(jìn)行分子生物學(xué)試驗的第一個關(guān)鍵步驟是提取出質(zhì)量好的總RNA[5-6]，但目前國內(nèi)外對芹菜莖總RNA提取的研究鮮有報道。因此，筆者比較幾種芹菜莖中總RNA的提取方法，旨在獲得一種適合芹菜莖組織總RNA提取的快速、高效的方法，為在從分子水平上對芹菜進(jìn)行研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1

研究對象。芹菜，采于金六環(huán)蔬菜產(chǎn)業(yè)基地，由實驗室-80 ℃保存。

1.1.2

主要儀器。AB104N電子天平，購自上海第二天平儀器廠；T100BIORAD pcr儀，購自鄭州南北儀器有限公司；HHS114水浴鍋，購自上海雷韻試驗儀器有限公司。

1.1.3

主要試劑。引物合成及擴(kuò)增產(chǎn)物測序，均由金維智生物科技有限公司完成；化學(xué)試劑、反轉(zhuǎn)錄酶和Tag酶，均購自天根生化科技有試驗限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純，市售。

1.2 方法

1.2.1

RNA提取的前處理。RNA提取過程中所用研缽、藥匙、玻璃器皿于180 ℃干熱處理至少4 h；塑料容器、耗材及配制藥品的ddH2O均用終濃度為0.1%的DEPC處理過夜，并用烘箱烘干。

1.2.2

Trizol法。①取100 mg新鮮的芹菜莖組織于液氮預(yù)冷的研缽中，迅速研磨，直至芹菜莖組織徹底粉碎；②將磨碎的芹菜莖組織放入含1.0 ml Trizol裂解液的離心管中，渦旋15 s，在室溫下放置5 min；③在上述離心管中，加入氯仿（每1.0 ml Trizol加0.2 ml氯仿），渦旋15 s，在室溫下放置2～3 min后，于12 000 r/min、4 ℃離心15 min；④吸取上層水相置于新離心管中，加入異丙醇（每1.0 ml Trizol加0.5 ml異丙醇），在室溫下放置10 min后，于12 000 r/min、4 ℃離心10 min；⑤棄上清，按照每1.0 ml Trizol加1.0 ml濃度75%乙醇進(jìn)行洗滌，輕輕搖晃洗滌，于12 000 r/min、4 ℃離心5 min；⑥棄上清，讓沉淀的RNA在室溫在自然干燥，用30 μl RNasefree water溶解RNA沉淀。

1.2.3

RNA prep Pure Plant Kit法。天根生化科技有限公司RNA prep Pure Plant Kit提取方法參考說明書。①取50～100 mg植芹菜莖在液氮中迅速研磨成粉末，加入500 μl已加入β巰基乙醇的SL，立即渦旋劇烈振蕩混勻，于12 000 r/min離心2 min；②將上清液轉(zhuǎn)移至過濾柱CS上（過濾柱CS放在收集管中），于12 000 r/min離心2 min，小心吸取收集管中的上清至新的RNaseFree的離心管中，吸頭盡量避免接觸收集管中的細(xì)胞碎片沉淀；③緩慢加入0.4倍上清體積的無水乙醇，混勻，將得到的溶液和沉淀一起轉(zhuǎn)入吸附柱CR3中，于12 000 r/min離心15 s，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CR3放回收集管中；④向吸附柱CR3中加入350 μl去蛋白液RW1，于12 000 r/min離心15 s，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CR3放回收集管中；⑤DNase I 工作液的配制：取10 μl DNase I儲存液放入新的RNaseFree離心管中，加入70 μl RDD溶液，輕柔混勻；⑥向吸附柱CR3中央加入80 μl的DNase I 工作液，室溫放置15 min。⑦向吸附柱CR3中加入350 μl去蛋白液RW1，于12 000 r/min離心15 s，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CR3放回收集管中；⑧向吸附柱CR3中加入500 μl漂洗液RW（使用前請先檢查是否已加入乙醇），于12 000 r/min離心15 s，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CR3放回收集管中，重復(fù)一次；⑨于12 000 r/min離心2 min，將吸附柱CR3放入一個新的RNaseFree離心管中，向吸附膜的中間部位懸空滴加30 μl RNaseFree ddH2O，室溫放置2 min，再于12 000 r/min離心1 min，得到RNA溶液。

1.2.4

RNA simple Total RNA Kit法。天根生化科技有限公司RNA simple Total RNA Kit提取方法參考說明書：①②③同Trizol法；④把水相轉(zhuǎn)移到新管中，緩慢加入0.5倍體積無水乙醇，混勻，將得到溶液和沉淀一起轉(zhuǎn)入吸附柱CR3中，于4 ℃、12 000 r/min離心30 s，棄掉收集管中的廢液；⑤向吸附柱CR3中加入500 μl已加入乙醇的去蛋白液RD，于4 ℃、12 000 r/min，離心30 s，棄廢液，將CR3放入收集管中；⑥向吸附柱CR3中加入700 μl已加入乙醇的漂洗液RW，室溫靜置2 min，于4 ℃、12 000 r/min，離心30 s，棄廢液，離心后將吸附柱CR3在室溫放置片刻以充分晾干；⑦將吸附柱CR3轉(zhuǎn)入一個新的離心管中，加30 μl RNasefree water 溶解RNA沉淀。

1.2.5

總RNA完整性檢測。分別取3種方法提取總RNA，在1.0%的瓊脂糖凝膠電泳上檢測，紫外光下觀察并拍照。

1.2.6

總RNA純度及濃度測定。分別取3種不同方法提取的總RNA各1.0 μl，用超微量分光光度計（Thermo NanoDrop 2000）測量OD260/OD280、OD260/OD230以及RNA的濃度，每個樣測量3次，取平均值。

1.2.7

RTPCR檢測。①cDNA第1鏈的合成。分別取3種方法提取的總RNA，根據(jù)表l依次加入不同組分，于42 ℃孵育30 min，于85 ℃加熱5 min。②RTPCR。根據(jù)已在GENEBANK中登陸的芹菜PAL基因序列（登錄號：L38898）設(shè)計特異引物PALF：5′GAAGCCTGAATTTACCGA3′，PALR：5′AGCACCCTTGAATC CATA3′；根據(jù)已在GENEBANK中登陸的芹菜4CL基因序列（登錄號：X13325）設(shè)計引物4CLF：5′TCGGTGAGGACGGTTAT3′，4CLR：5′TCGGAAATGGTAGGATGA3′，芹菜內(nèi)參βactin特異引物參考已發(fā)表文章[7]，βactinF：5′CTTCCTGCCATATATGATTGG3′，βactinR：5′GCCAGCACCTCGATCTTCATG3′。PCR體系見表2，反應(yīng)程序為：95 ℃，3 min，95 ℃變性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，共25個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。擴(kuò)增產(chǎn)物于1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.8

凝膠回收測序。PCR產(chǎn)物回收按照天根生化科技有限公司的瓊脂糖凝膠回收試劑盒（DP209）說明書進(jìn)行，回收產(chǎn)物交由金維智生物科技有限公司測序。使用DNAMAN軟件，對膠回收產(chǎn)物測序結(jié)果和已經(jīng)登錄在GENBANK的PAL、4CL序列與進(jìn)行同源性比對。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同方法提取RNA結(jié)果分析

2.1.1

RNA純度及濃度測定。已知OD260/OD280、OD260/OD230的比值在1.8～2.0為質(zhì)量好的RNA[8]，可以用作后續(xù)試驗。由表3可知，RNA prepPure Plant Kit方法得率低，且OD260/OD280值低于1.8，Trizol法OD260/OD230高于2.0，且得率低于RNA simple Total RNA kit法。只有RNA simple Total RNA kit法提取的RNA質(zhì)量最好，得率最高，滿足條件。

2.1.2

RNA樣品凝膠電泳分析。凝膠電泳分析是判斷所提取RNA質(zhì)量的一種重要的手段。從電泳膠上18S和28SrRNA的完整性，可以判斷RNA有無降解及降解程度，也可以判斷得率情況。圖1表明，Trizol法和RNA prepPure Plant Kit法提取條帶較暗，說明提取的RNA濃度低，且Trizol法提取的在進(jìn)樣孔里有一條模糊的條帶，說明有蛋白質(zhì)污染。只有RNA simple Total RNA Kit法提取RNA28S亮度是18s的2倍，條帶完整，帶與帶之間沒有明顯的彌散，點樣孔內(nèi)無亮斑，整個條帶無拖尾現(xiàn)象，說明RNA相對比較純凈，無蛋白質(zhì)污染，質(zhì)量最好。綜上所述，采用RNA simple Total RNA Kit法提取芹菜莖總RNA，效果最理想。

注：1為Trizol法；2為RNA prepPure Plant Kit法；3為RNA simple Total RNA Kit法。

圖1 不同方法提取芹菜總RNA電泳結(jié)果

2.1.3

半定量RTPCR檢測結(jié)果。圖2表明，以cDNA為

模板擴(kuò)增PAL、4CL、ACTIN經(jīng)凝膠電泳檢測后，可清晰的看

到3條亮帶，目的序列的大小分別為為487、491和250 bp，與得到的PCR產(chǎn)物大小一致，并且條帶清晰，整齊。使用DNAMAN軟件對PAL、4CL進(jìn)行同源性比對可知，試驗擴(kuò)增得到的PAL、4CL序列與已經(jīng)在GENBANK登錄的PAL、4CL序列的同源性分別達(dá)到96.38%、93.42%，說明試驗反轉(zhuǎn)錄的cDNA質(zhì)量較好，具有可重復(fù)操作性，更進(jìn)一步說明了按RNA simple Total RNA Kit方法提取芹菜莖屬總RNA質(zhì)量高，能滿足后續(xù)的分子生物學(xué)試驗的要求（圖3～4）。

3 討論

不同的RNA提取方法各有其優(yōu)缺點，應(yīng)對不同的植物組織選擇不同的RNA提取方法，以滿足后續(xù)分子生物學(xué)試驗的要求。Trizol法在提取植物總RNA方面應(yīng)用比較廣泛，但該方法提取繁瑣，耗時長，吸取上清液時極容易有蛋白質(zhì)的污染；同時，提取的RNA很容易混有芹菜莖固有色素，影響最終RNA濃度的檢測，對后續(xù)分子生物學(xué)試驗有很大的影響。RNA prepPure Plant Kit法主要針對含多糖多酚的植物組織的提取，成本高，操作復(fù)雜，RNA得率低。RNA simple Total RNA Kit法操作簡單，成本低，是在Trizol法的基礎(chǔ)上經(jīng)過改進(jìn)開發(fā)的新一代產(chǎn)品，提高了裂解液的裂解能力和提取的靈敏度，同時對硅基質(zhì)膜的改進(jìn)增強(qiáng)了對RNA的吸附能力，并添加蛋白洗脫液，2 h左右即可提取到芹菜莖的總RNA，既保證了無蛋白質(zhì)和色素雜質(zhì)的污染，又防止因操作復(fù)雜導(dǎo)致的RNA降解，得到的RNA質(zhì)量很好，這可能就是