張振春

【摘要】目的：研究紙片法快速檢測水中總大腸菌群方法。方法：將采集到的水樣，按GB/T5750.12-2006《生活飲用水標準檢驗方法 微生物指標》中多管發(fā)酵法和水中總大腸菌群紙片法同時測定水中總大腸菌群。結(jié)果：總大腸菌群紙片法快速檢測結(jié)果與國標多管發(fā)酵法測定結(jié)果比較無顯著性差異，兩種方法具有較好的相關性，相關系數(shù)為0.9670。結(jié)論：總大腸菌群紙片法與國標法相比無顯著性差異，具有一定的可行性，值得推廣。

【關鍵詞】總大腸菌群；紙片法；快速檢測；多管發(fā)酵法

Abstract：objective: to study the paper method of rapid detection method of total coliform bacteria in water. Methods: water samples were collected, according to GB/T5750.12-2006 "standard of drinking water test method of microbial indicators of multi-tube fermentation and total coliform bacteria in water paper method of determination of total coliform bacteria in water at the same time. Results: the total coliforms paper method Rapid test results compared with the national standard determination of multi-tube fermentation, there was no significant difference of two methods has good correlation, the correlation coefficient of 0.9670. Conclusion: the total coliforms paper method to there was no significant difference compared with national standard method, it has certain feasibility, is worth promoting.

Key words：total coliform bacteria; Pieces of paper; Rapid detection; Multiple tube fermentation

【中圖分類號】R4【文獻標識碼】A【文章編號】1671-8801（2014）08-0024-02

總大腸菌群是評價水中糞便污染程度的一個重要指標，目前國家標準方法GB/T5750.12-2006中（1）多管發(fā)酵法（2）濾膜法（3）酶底物法，大多數(shù)主要采用多管發(fā)酵方法，其具有準確性好、可靠性高、靈敏性好等特點，但是需要做大量的實驗準備工作且需要較長的時間才能獲得檢測結(jié)果，試驗操作繁瑣，需要進行初發(fā)酵，平板分離培養(yǎng)，染色鏡檢和復發(fā)酵等試驗步驟，不適用于對樣品進行快速檢測。因此研究水中總大腸菌群快速檢測方法是十分必要的。

紙片法是采用中國疾病預防控制中心營養(yǎng)與食品安全所監(jiān)制，保定市康達醫(yī)學用品研究所研制的大腸菌群快速檢驗紙片，具有操作簡單，可直接加入樣品，在16-18小時內(nèi)可獲得檢測結(jié)果等優(yōu)點，特別適合工作量大，及衛(wèi)生監(jiān)督工作的需要。

1 材料與方法

1.1樣品

實驗樣品來自遼寧省沈陽市康平縣農(nóng)村安全飲水工程中的水源井。

1.2試劑

多管發(fā)酵法：乳糖蛋白胨培養(yǎng)基和伊紅美藍培養(yǎng)基均來自杭州天和微生物試劑有限公司，革蘭氏染液試劑來自杭州天和微生物試劑有限公司。

紙片法：紙片是來自保定市康達醫(yī)學用品研究所。

1.3儀器

多管發(fā)酵法：試管、發(fā)酵管、500mL滅菌玻璃廣口瓶、滅菌平皿、天平、CX31OLYMPUS顯微鏡(日本株式會社生產(chǎn))、BSC-1360ⅡA2生物安全柜（北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司）、LMQ.J高壓蒸汽滅菌器（山東新華醫(yī)療器械廠生產(chǎn)）、滅菌吸管、滅菌吸管、載玻片、接種環(huán)和DHP-420S恒溫培養(yǎng)箱（北京永光明醫(yī)療儀器廠）。

紙片法：試管、BSC-1360ⅡA2生物安全柜（北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司）、LMQ.J高壓蒸汽滅菌器（山東新華醫(yī)療器械廠生產(chǎn)）、滅菌吸管、DHP-9162

恒溫培養(yǎng)箱（上海一恒科技有限公司）。

1.4采樣方法

用500mL滅菌玻璃瓶取水樣封口編號送實驗室檢測。

1.5檢測方法

1.5.1多管發(fā)酵法（國標法）：按GB/T5750.12-2006中 2.1.5具體操作步驟如下：

（1）乳糖發(fā)酵試驗:取10mL水樣接種到10mL雙料乳糖蛋白胨培養(yǎng)液中，取1mL水樣接種到10mL單料乳糖蛋白胨培養(yǎng)液中，另取1mL水樣注入到9滅菌生理鹽水中，混勻后吸取1mL注入到10mL單料乳糖蛋白胨培養(yǎng)液中，每一稀釋度接種5管。將接種管置36℃培養(yǎng)箱內(nèi)，培養(yǎng)24小時，如所有乳糖蛋白胨培養(yǎng)管都不產(chǎn)氣產(chǎn)酸則可報告為總大腸菌群陰性，如有產(chǎn)酸產(chǎn)氣者，則按下列步驟進行。

（2）分離培養(yǎng)：將產(chǎn)酸產(chǎn)氣的發(fā)酵管分別接種在伊紅美藍瓊脂平板上，于36℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24小時，觀察菌落形態(tài)，挑取符合下列特征的菌落作革蘭氏染色、鏡檢和證實試驗。

深紫黑色、具有金屬光澤的菌落；

紫黑色、不帶或略帶金屬光澤的菌落；

淡紫紅色、中心較深的菌落。

（3）證實試驗：經(jīng)上述染色鏡檢為革蘭氏陰性無芽孢桿菌，同時接種乳糖蛋白胨培養(yǎng)液，置36℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時，有產(chǎn)酸產(chǎn)氣者，即證實有總大腸菌群存在。

根據(jù)證實為總大腸菌群陽性的管數(shù)，查MPN檢索表，報告每100mL水樣中的總大腸菌群最可能數(shù)（MPN）值。如所有乳糖發(fā)酵管均陰性時，可報告總大腸菌群未檢出。

1.5.2紙片法：

5袋大紙片每袋用無菌吸管各接種水樣10mL；10袋小紙片其中5袋接種水樣各1mL,另5袋接種1：10水樣稀釋液各1mL,總接種量為55.5mL。將接種好的紙片置于37℃恒溫培養(yǎng)箱16-18小時取出觀察結(jié)果。紙片保持藍紫色不變或在藍紫色背景上呈現(xiàn)紅色菌落但紅色菌落周圍無黃暈為大腸菌群陰性紙片，紙片出現(xiàn)紅色菌落其周圍有黃暈或黃色背景下呈現(xiàn)紅色菌落或片狀紅暈為大腸菌群陽性。記錄陽性紙片袋數(shù)根據(jù)大腸菌群MPN檢索表報告。

2 結(jié)果

表1 多管發(fā)酵法和紙片法檢測結(jié)果（MPN/100mL）

樣品編號 多管發(fā)酵法 紙片法 樣品編號 多管發(fā)酵法 紙片法

100 1100

245 1222

300 1368

4 19 17 14 12 10

5 11 13 1522

6 221644

7 441767

8 25 29 189 11

9 17 17 197 6

1000209 9

計算統(tǒng)計值t=0.154，查t0.05=2.021，t

為了進一步研究兩種方法的相關性，將表1中的兩種方法測定結(jié)果做圖，以紙片法測定結(jié)果為縱坐標，以多管發(fā)酵法測定結(jié)果為橫坐標，如圖1所示。從圖1中可見兩種方法測定結(jié)果呈線性相關，相關系數(shù)為0.9670。

圖1 多管發(fā)酵法和紙片法測定結(jié)果相關性分析

3 討論

水中總大腸菌群檢測數(shù)據(jù)表明：紙片法快速檢測結(jié)果在多管發(fā)酵法檢測的結(jié)果的±10%之內(nèi)波動，經(jīng)t檢驗兩種方法沒有顯著性差異。兩種方法有較好的相關性，相關系數(shù)為0.9670，這表明總大腸菌群快速檢測法應用于水中總大腸菌群的測定具有一定的可行性。

總大腸菌群快速檢測法相對于傳統(tǒng)的多管發(fā)酵法具有明顯優(yōu)點:方法簡單易懂，工作人員不需要特殊培訓；操作過程簡便易學，不需要太多的儀器；檢測時間短，無需確認試驗，能夠較快捷、準確地檢測水中總大腸菌群。

參考文獻：

[1]GB/T5750.12-2006. 生活飲用水標準檢驗方法 微生物指標。