楊晶晶　陳麗華　李興玉　吳毅歆　陳映嵐　何月秋

摘要[目的]研究化學(xué)誘變枯草芽孢桿菌對大白菜根腫病的防治效果。[方法]采用3株來自枯草芽孢桿菌XF1的化學(xué)誘變菌株XF1A、XF1C和XF1E進(jìn)行大白菜根腫病的盆栽防病試驗(yàn)，并以MALDITOFMS分析了3種抗生素的相對含量。[結(jié)果]菌株XF1A和XF1C防效較好，分別為68.80%和65.06%，XF1E防效較差為42.21%。3菌株均能分泌表面活性素、伊枯草菌素和豐源素，但表面活性素和伊枯草菌素相對含量為XF1A>XF1C>XF1E，XF1A的表面活性素和伊枯草菌素分別達(dá)29.26%和35.31%，XF1E的豐源素含量最高，達(dá)41.09%。[結(jié)論]表面活性素和伊枯草菌素含量與對根腫病防治效果存在一定的關(guān)聯(lián)性

關(guān)鍵詞根腫?。槐砻婊钚运?；伊枯草菌素；豐源素

中圖分類號S432.4+2文獻(xiàn)標(biāo)識碼A文章編號0517-6611（2014）09-02597-03

基金項(xiàng)目農(nóng)業(yè)部公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項(xiàng)（201003029）；云南省支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2009EB060）。

作者簡介楊晶晶（1985- ），男，云南曲靖人，碩士研究生，研究方向：植物病害可持續(xù)管理。*通訊作者，教授，博士生導(dǎo)師，從事病害可持續(xù)控制方面的研究。

十字花科根腫病是由蕓苔根腫菌侵染引起的病害[1]。該菌主要侵染十字花科植物根部，在根部組織中產(chǎn)生細(xì)胞分裂素和吲哚乙酸等物質(zhì)，引起根部薄壁細(xì)胞大量分裂和增生，從而形成腫瘤，植株地上部出現(xiàn)矮化、失水、萎蔫直至死亡，根部出現(xiàn)根瘤狀物[2-6]。某些枯草芽孢桿菌能產(chǎn)生多種抗菌活性物質(zhì)，以伊枯草菌素（Iturin）、表面活性素（surfactin）、豐源素（fengycin）三大家族為主[7]。伊枯草素能夠影響細(xì)胞膜的表面張力，增加生物分子脂質(zhì)膜的導(dǎo)電性[8]，導(dǎo)致微孔的形成、K+及其他重要離子的滲漏，最后引起細(xì)胞死亡[9]，具有較強(qiáng)的抗真菌活性[10]，也有部分抑制細(xì)菌的作用[11]；表面活性素具有抗病毒、抗腫瘤、抗支原體和抗細(xì)菌活性[12]；豐源素能抑制真菌生長，尤其對絲狀真菌抑制活性最強(qiáng)[13]。

由于根腫病防治較難，目前田間防治主要采用化學(xué)農(nóng)藥，但因化學(xué)農(nóng)藥對土壤環(huán)境有負(fù)面影響，且不宜長期使用。為尋找有效、更安全的防治方法，筆者開展了3株化學(xué)誘變的枯草芽孢桿菌盆栽防病試驗(yàn)，同時測定其抗生素類含量。

1材料與方法

1.1菌株來自防治根腫病效果較好的枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）XF1化學(xué)誘變菌株XF1A、XF1C、XF1E和云南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)生物多樣性應(yīng)用技術(shù)國家工程中心保存的三七根腐病菌（Fusarium soloni）以及田間采回的活體根腫病菌。

1.2試劑與材料乙腈（ACN）（色譜純），三氟醋酸（TFA）（色譜純），α氰基4羥基肉桂酸（CHCA）（色譜純），重蒸水，白菜種子（青島831），花盆（上口直徑15.0 cm，下口直徑10.5 cm，高12.5 cm）。

質(zhì)譜儀：Bruker Autoflex Speed MALDITOFMS（Bruker Daltonics，Billerica，MA，USA）。

提取溶劑：70 ml乙腈，0.1 ml TFA，用重蒸水定容至100 ml。

輔助基質(zhì)溶液配制：常溫下用提取溶劑溶解CHCA配成飽和溶液。

1.3枯草芽孢桿菌抑菌試驗(yàn) （1）挑取三七根腐菌絲塊接于PD培養(yǎng)基，培養(yǎng)72 h（28 ℃，140 r/min），將培養(yǎng)菌液稀釋100倍，取100 μl稀釋的菌液涂布于PDA平板上，再接種單菌落的芽孢桿菌，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)3 d，觀察抑菌結(jié)果。

（2）將試驗(yàn)菌株單菌落接種于4瓶250 ml LB液體培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)72 h（37 ℃，150 r/min），25 ℃、10 000 r/min條件下離心10 min，收集上清液1 000 ml，加入硫酸銨至80%飽和度，4 ℃沉淀24 h，收集沉淀冷凍干燥，稱取冷凍干燥的提取物0.1 g加入900 μl無菌水溶解。將培養(yǎng)72 h的三七根腐菌稀釋100倍，取100 μl涂布于PDA 培養(yǎng)基上，用直徑6 mm打孔器打孔，在孔中加入提取物的水溶液20 μl，置28 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)3 d。

1.4盆栽試驗(yàn)

1.4.1白菜種植。采集不含根腫孢子的耕作層土壤，加入草炭和珍珠巖混拌均勻（土壤∶草炭∶珍珠巖= 2∶1∶1），稱取1 000 g置入直徑15 cm的花盆中，同時稱取3 g新鮮根腫組織，加50 ml無菌水，以水果榨汁勻漿機(jī)打碎，加入無菌水至體積為100 ml混勻，澆灌于上述準(zhǔn)備的土壤表面，待花盆表面土層水分滲透后，疏松土壤表面，并均勻播種25粒感病大白菜品種“青島831”種子，覆土約1 cm。

1.4.2處理設(shè)計(jì)與栽培管理。設(shè)4個處理，分別為XF1A、XF1C、XF1E和空白對照（CK），每個處理3個重復(fù)。各試驗(yàn)菌株分別于250 ml LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、180 r/min培養(yǎng)72 h，然后分別稀釋5倍（約107個/ml），取100 ml均勻澆入盆中，CK以LB培養(yǎng)液稀釋5倍澆入。每隔4 d澆菌液1次，共澆5次。在第5和10天間苗，最終每盆中保留14苗。

1.4.3病情調(diào)查。35 d采收大白菜，將所有的白菜拔起，用水清洗根部泥土，根據(jù)分級標(biāo)準(zhǔn)[14]調(diào)查根腫病的發(fā)生情況。

盆栽苗期病情分級標(biāo)準(zhǔn)：0級：根部無腫瘤；1級：僅側(cè)根腫大，側(cè)根有小腫瘤；3級：主根腫大，其直徑小于2倍莖基部；5級：主根腫大，其直徑是莖基部的2～3倍；7級：主根腫大，其直徑是莖基部的3～4倍；9級：主根腫大，其直徑是莖基部的4倍以上，或腫瘤龜裂。

病情指數(shù)=（各級病株數(shù)×相應(yīng)病級數(shù)）調(diào)查總數(shù)×9×100

防治效果（%）=對照病情指數(shù)-處理病情指數(shù)對照病情指數(shù)×100

1.5MALDITOFMS檢測挑取各生防菌20個單菌落分別裝于2 ml離心管中，各加入1 ml提取溶劑，振蕩2 min后在12 000 r/min、4 ℃條件下離心20 min，取上清液分別裝于1.5 ml離心管中保存于4 ℃冰箱中。取2 μl細(xì)胞表面提取液于目標(biāo)板孔靶上，加等體積的輔助基質(zhì)混勻，自然風(fēng)干后進(jìn)行MALDITOFMS檢測。儀器參數(shù)為反謝操作模式；正離子檢測；檢測范圍100～2 000 Da；激光點(diǎn)擊數(shù)每圖譜50；激光頻率30.0 Hz；離子源加速電壓20 kV；反謝電壓23.5 kV脈沖離子。

2結(jié)果與分析

2.13個菌株的抑菌活性菌株和其代謝產(chǎn)物對三七根腐病菌的抑菌結(jié)果見圖1。由圖1可知，枯草芽孢桿菌XF1A、XF1C和XF1E對三七根腐病菌有較強(qiáng)的拮抗作用，培養(yǎng)3 d后形成透明的抑菌圈，抑菌圈大小為1.2～1.4 cm，3個菌株的抑菌作用較菌株XF-1增強(qiáng)；發(fā)酵菌株的上清液對三七根腐病菌的拮抗作用優(yōu)于野生菌株XF1。注：1為接菌株，2、3、4分別為菌株提取液。

2.3MALDITOFMS檢測枯草芽孢桿菌的次生代謝物3株枯草芽孢桿菌細(xì)胞表面提取物經(jīng)MALDITOFMS檢測，證明它們均能分泌表面活性素、伊枯草菌素和豐源素，且這3類環(huán)脂肽化合物為3菌株細(xì)胞表面提取物的主要成分。但3類物質(zhì)在各菌株中的相對含量不同（圖3），其中表面活性素和伊枯草菌素相對含量為XF1A>XF1C>XF1E，XF1A的表面活性素和伊枯草菌素最高，分別為29.26%和35.31%，XF1E的豐源素最高，高達(dá)41.09%。

3討論

由于根腫病菌不能在人工培養(yǎng)基中培養(yǎng)，該研究采用三七根腐病菌為指示菌。在3株化學(xué)誘變的枯草芽孢桿菌拮圖2枯草芽孢桿菌處理后大白菜根腫病癥狀圖33個菌株環(huán)肽抗生素含量抗真菌的試驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)菌株及其發(fā)酵液提取物對三七根腐病菌均具有拮抗作用，且較野生型菌株XF-1有明顯提高。大白菜根腫病的盆栽防治試驗(yàn)結(jié)果顯示，枯草芽孢桿菌XF1A和XF1C對根腫病的防治效果較好，XF1E的防治效果較差。分析防病效果與三七根腐病菌（F.solani）的拮抗作用，兩者之間沒有直接的聯(lián)系，即拮抗能力強(qiáng)的菌株不一定對根腫病有較好的防效。這可能與三七根腐病菌同十字花科作物根腫病菌形態(tài)結(jié)構(gòu)等存在差異有關(guān)。因此，盡管三七根腐病菌具有生長快、產(chǎn)孢量大、同根腫病菌細(xì)胞壁由幾丁質(zhì)組成等優(yōu)點(diǎn)，但在篩選防治根腫病的生防菌株時，在得到大量具抑菌作用的生防菌株后，應(yīng)以根腫病菌作為靶標(biāo)進(jìn)行復(fù)篩，以提高篩選優(yōu)良生防菌株的工作效率和降低成本。MALDITOFMS檢測發(fā)現(xiàn)代謝產(chǎn)物有較大的變化，菌株XF1A和XF-1C代謝物中表面活性素和伊枯草菌素的相對含量較高，防病效果較好，而菌株XF1E代謝物中表面活性素和伊枯草菌素的相對含量較低，防病效果差。

3突變菌株代謝物伊枯草菌素、表面活性素和豐源素相對含量變化差異明顯，但有一共同的趨勢：伊枯草菌素和表面活性素相對含量較高時，豐源素的相對含量較低（突變菌株XF1A和XF1C）；豐源素相對含量較高時，伊枯草菌素和表面活性素相對含量較低（突變菌株XF1E）。董偉欣等[15]研究NCD2菌株發(fā)現(xiàn)，脂肽提取物中主要為豐源素，缺失fenC基因的突變子喪失了豐源素的合成能力，但突變子中產(chǎn)生了一種與桿菌霉素D（bacillomycin D）具有一致分子量的新物質(zhì)。李興玉[16]檢測解淀粉芽孢桿菌B9601Y2代謝產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)其豐源素相對含量高達(dá)68.75%，但沒有檢測到表面活性素，檢測到少量的伊枯草菌素，該菌株對多種真菌具有較強(qiáng)拮抗作用。在野生XF1菌株中豐源素相對含量較高，伊枯草菌素和表面活性素相對含量較低，其中伊枯草菌素的相對含量遠(yuǎn)低于豐源素[16]。比較分析的結(jié)果表明，枯草芽孢桿菌的代謝產(chǎn)物中豐源素類物質(zhì)的合成影響伊枯草菌素的合成，兩者呈負(fù)相關(guān)，即當(dāng)菌株豐源素產(chǎn)物的相對含量提高時，伊枯草菌素產(chǎn)物的相對含量降低。

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