張總澤　陳艷　林陽(yáng)武　李敏

摘要 [目的] 采用SSCOI技術(shù)鑒定雅點(diǎn)六齒小蠹。[方法]采用基于線粒體DNA細(xì)胞色素C氧化酶亞基I（mtDNA COI）基因序列的種特異性（speciesspecific COI，SSCOI）PCR方法，設(shè)計(jì)雅點(diǎn)六齒小蠹SSCOI引物ipsc1和ipsc2。[結(jié)果] 該引物特異性強(qiáng)，能擴(kuò)增出清晰、單一的長(zhǎng)度為594bp的特異性條帶，與白云杉齒小蠹（Ips perturbatus）、黑條木小蠹（Trypodendron lineatum）、橡膠材小蠹（Xyleborus affini）、歐洲根小蠹（Hylastes ater）、咖啡果小蠹（Hypothenemus hampei）、長(zhǎng)林小蠹（Hylurgus ligniperda）進(jìn)行對(duì)照，均無(wú)條帶出現(xiàn)。[結(jié)論]建立的雅點(diǎn)六齒小蠹PCR鑒定方法在實(shí)際檢疫工作中得到驗(yàn)證和應(yīng)用，表明該方法特異、靈敏、穩(wěn)定，可以應(yīng)用于口岸檢疫鑒定工作。

關(guān)鍵詞雅點(diǎn)六齒小蠹；SSCOI；PCR；檢測(cè)

中圖分類號(hào)S433.5文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào)05176611（2014）09-02588-02

基金項(xiàng)目福建檢驗(yàn)檢疫局科技計(jì)劃項(xiàng)目（FK201159，F(xiàn)K201224）；質(zhì)檢公益性行業(yè)科研專項(xiàng)（201410076）。

作者簡(jiǎn)介張總澤（1984- ），男，內(nèi)蒙古牙克石人，農(nóng)藝師，從事昆蟲檢疫鑒定工作。

雅點(diǎn)六齒小蠹Ips concinnus Mannerheim，又名粒點(diǎn)六齒小蠹、西特喀云杉齒小蠹，屬于鞘翅目（Coleoptera）、小蠹科（Scolytidae）、齒小蠹屬（Ips），分布于美國(guó)（阿拉斯加、加利福尼亞、俄勒岡、華盛頓）和加拿大（不列顛哥倫比亞），為害西特喀云杉Picea sitchensis （Bong.） Carrière，是我國(guó)進(jìn)境植物檢疫性有害生物。該蟲屬于初期性害蟲，以幼蟲和成蟲侵害健康樹木，取食寄主的有機(jī)成分，造成寄主大面積死亡。我國(guó)是木材進(jìn)口大國(guó)，近年來(lái)，隨著國(guó)際貿(mào)易的不斷增長(zhǎng)，進(jìn)口木材和木質(zhì)包裝量也日益增加，特別是一些口岸直接進(jìn)口未經(jīng)處理的北美原木，使該蟲入侵的風(fēng)險(xiǎn)極大，我國(guó)口岸曾多次截獲該蟲[1-2]。由于該蟲在我國(guó)尚未分布，所以，加強(qiáng)檢疫是防治該蟲最為重要的技術(shù)措施。

雅點(diǎn)六齒小蠹的鑒定主要基于成蟲的形態(tài)特征，包括額面特征、前胸背板刻點(diǎn)、鞘翅末端的齒、雄蟲生殖器等[3]。而對(duì)于口岸檢驗(yàn)檢疫工作中常截獲到的幼蟲，則無(wú)法用常規(guī)的形態(tài)學(xué)手段鑒定，給快速通關(guān)和貿(mào)易便利化造成困難。近年來(lái)，應(yīng)用分子生物學(xué)方法鑒定有害生物越來(lái)越廣泛，特別是PCR方法，由于具有快速、微量、靈敏等顯著優(yōu)點(diǎn)，在各口岸檢驗(yàn)檢疫部門已經(jīng)普及。筆者采用基于線粒體DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）細(xì)胞色素C氧化酶亞基I（cytochrome c oxidase subunit I，COI）基因序列的種特異性PCR（speciesspecific COI，SSCOI）方法[4]，設(shè)計(jì)了雅點(diǎn)六齒小蠹的特異性引物，對(duì)該方法進(jìn)行了技術(shù)驗(yàn)證，為快速準(zhǔn)確鑒定該蟲提供技術(shù)保障。

1材料與方法

1.1供試蟲源雅點(diǎn)六齒小蠹（Ips concinnus）、白云杉齒小蠹（Ips perturbatus）、黑條木小蠹（Trypodendron lineatum）、橡膠材小蠹（Xyleborus affinis）、歐洲根小蠹（Hylastes ater）、咖啡果小蠹（Hypothenemus hampei）、長(zhǎng)林小蠹（Hylurgus ligniperda）均為福建口岸近年檢疫截獲的小蠹科昆蟲標(biāo)本，所有試蟲均為成蟲，經(jīng)形態(tài)學(xué)鑒定后用于研究。

1.2DNA提取采用生工磁珠法動(dòng)物基因組DNA抽提試劑盒（上海生工生物工程有限公司）提取試蟲DNA。具體步驟：取單頭小蠹成蟲，去除鞘翅后置于-20 ℃冷凍10 min，取出后迅速放入1.5 ml離心管中[5]，加入裂解液（400 μl Buffer MACL，200 μl Buffer MCL和20 μl Proteinase K），用塑料研磨棒充分研磨蟲體，然后按說(shuō)明書步驟操作，提取的DNA置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3引物設(shè)計(jì)登錄Genebank，查詢下載小蠹蟲COI基因序列（Genebank登錄號(hào)見表1）。利用Primer 5和Oligo 6軟件，根據(jù)引物設(shè)計(jì)原則[6-7]，設(shè)計(jì)1對(duì)雅點(diǎn)六齒小蠹SSCOI引物：上游引物ipsc1 5′ATGTGGATACACGAGCATACTTTACC3′；下游引物ipsc2 5′GTAATCATTCAATAGAGGC3′。引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.4PCR擴(kuò)增PCR反應(yīng)體系為25 μl，其中2×Taq PCR Master Mix（天根生化科技有限公司）12.5 μl，上下游引物各1 μl（10 pmol/L），模板DNA 1 μl，ddH2O 9.5 μl。經(jīng)預(yù)試驗(yàn)優(yōu)化，PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min；35個(gè)循環(huán)：94 ℃ 40 s，55.5 ℃ 40 s，72 ℃ 50 s；最后72 ℃延伸10 min。取10 μl PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，在1.5%瓊脂糖凝膠上以90 V電泳分離30 min，染色后在凝膠成像儀上觀察結(jié)果。

1.5特異性及靈敏度試驗(yàn)

1.5.1特異性試驗(yàn)。選取6種小蠹蟲成蟲，經(jīng)形態(tài)學(xué)鑒定后按照“1.2”的方法提取DNA，以雅點(diǎn)六齒小蠹為陽(yáng)性對(duì)照。先用小蠹蟲通用引物C1J2183和C1N2611進(jìn)行PCR擴(kuò)增[8]，以驗(yàn)證DNA提取質(zhì)量。然后用SSCOI引物ipsc1和ipsc2進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以檢驗(yàn)該引物的種特異性。

1.5.2靈敏度試驗(yàn)。將提取的雅點(diǎn)六齒小蠹DNA按10-1、10-2、10-3、10-4、10-5倍梯度稀釋，用SSCOI引物ipsc1和ipsc2進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以檢驗(yàn)該檢測(cè)方法的靈敏度。

1.6PCR方法的驗(yàn)證與應(yīng)用用口岸截獲的小蠹科昆蟲DNA為模板，以雅點(diǎn)六齒小蠹為陽(yáng)性對(duì)照，用特異性引物ipsc1和ipsc2進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以檢驗(yàn)該方法的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性。

2結(jié)果與分析

2.1DNA提取質(zhì)量檢驗(yàn)利用小蠹蟲通用引物C1J2183和C1N2611對(duì)提取的7種小蠹蟲DNA模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，電泳結(jié)果顯示，7種小蠹蟲均能擴(kuò)增出清晰單一的目的片段，長(zhǎng)度約為470 bp（圖1）。說(shuō)明所提取的DNA模板純度較高，能滿足試驗(yàn)需求。

3討論

準(zhǔn)確的物種鑒定是檢疫工作的首要任務(wù)和基本前提。口岸檢驗(yàn)檢疫部門對(duì)于截獲的幼蟲，一般情況下要將其在室內(nèi)飼養(yǎng)至成蟲，但受檢測(cè)周期長(zhǎng)、小蠹蟲的飼養(yǎng)難度大等限制，不能滿足快速通關(guān)的要求。近年來(lái)，利用分子生物學(xué)技術(shù)快速鑒定昆蟲種類已經(jīng)成為趨勢(shì)，在mtDNA COI基因序列分析技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的SSCOI引物鑒定技術(shù)，由于具有重現(xiàn)性好且條帶單一等優(yōu)點(diǎn)，在昆蟲快速鑒定中得到廣泛應(yīng)用。