陳曉晶　潘振　趙軍

摘要[目的]研究玉米抗逆相關轉錄因子ABP9在玉米抗逆應答中的功能及其表達調控機理。[方法]以2葉期玉米葉片為材料分離原生質體，通過PEG介導的轉化方法，建立玉米葉肉原生質體瞬時表達ABP9的系統(tǒng)。利用該系統(tǒng)，通過反轉錄PCR和Western blot分別檢測ABP9genomic∷FLAG融合基因在原生質體中的轉錄和翻譯；并通過轉化ABP9∷GFP融合表達載體和GFP熒光檢測，對ABP9進行亞細胞定位。[結果]玉米原生質體瞬時表達ABP9系統(tǒng)中，ABP9genomic∷FLAG融合基因能夠正確轉錄出mRNA并翻譯出蛋白質；利用該系統(tǒng)進行亞細胞定位結果顯示ABP9定位于細胞核中。[結論]玉米原生質體瞬時表達ABP9體系的建立，為進一步探究玉米中ABP9的表達和調控提供了良好的實驗系統(tǒng)。

關鍵詞玉米（Zea mays L.）；轉錄因子；ABP9（ABRE Binding Protein 9）；原生質體瞬時表達

中圖分類號S513文獻標識碼A文章編號0517-6611（2014）09-02554-05

基金項目國家轉基因生物新品種培育重大專項（編號：2013ZX08003-004）。

作者簡介陳曉晶（1988-），女，河北晉州人，碩士研究生，研究方向：植物抗逆分子生物學。*通訊作者，研究員，博士，從事植物抗逆分子生物學和基因工程研究。

玉米（Zea mays L.）是全球種植范圍最廣、產量最大的谷類作物，居3大糧食（玉米、小麥和大米）之首[1]。據(jù)統(tǒng)計，目前我國玉米種植面積為35 029 820×103 km2，總產量20 561.41×104 t，玉米已經成為我國種植面積最大、總產量最高的糧食作物（國家統(tǒng)計局 2012）。玉米同時也作為重要的飼料作物和工業(yè)原料，是世界糧食安全和能源安全不可或缺的一部分。然而，自然環(huán)境下，玉米的生長經常受到干旱、低溫、鹽漬等逆境的脅迫，嚴重影響玉米的產量，威脅糧食安全。

轉錄因子在調控植物生長發(fā)育、繁殖、胞間信號、細胞周期、代謝以及應答外界環(huán)境中起著重要的作用[2]。近年來，研究者相繼從高等植物中分離出一些調控逆境相關基因表達的轉錄因子。增強一個轉錄因子的作用，就可通過其促使多個抗逆基因發(fā)揮作用。因此，在植物抗逆分子育種中，與導入或改良個別功能基因來提高某種抗性的傳統(tǒng)方法相比，改良或增強一個關鍵的轉錄因子是綜合改良植株性狀更為有效的方法和途徑[3]。

bZIP轉錄因子是真核生物中分布最廣泛、最保守的一類轉錄因子。實驗室前期工作通過酵母單雜交的方法，從授粉后17 d的玉米幼胚cDNA文庫中篩選出了與玉米Cat1（catalase isozyme 1）基因順式元件ABRE2相互作用的bZIP類轉錄因子ABP9（ABRE Binding Protein9），并證明其在酵母細胞中具有轉錄激活功能[4]。基因槍轉化玉米懸浮細胞瞬時表達分析表明，ABP9在植物細胞中也具有ABRE結合特性和轉錄激活功能[5]。已有研究通過轉基因的手段，分析了轉ABP9基因的擬南芥[5]、小麥[6]、黑麥草、高羊茅[7]、水稻[8]等的耐非生物逆境的抗性，結果表明ABP9過表達植株對干旱、寒冷和鹽漬等非生物脅迫的耐受能力明顯增強。Zhang等研究表明，過表達ABP9的擬南芥中，ABP9通過調節(jié)一系列ROS清除相關的抗氧化酶類基因（CSD1，CAT3等）的表達以及ROS 信號傳導相關的調節(jié)基因（Zat10，SRO5等）的表達，參與植物體內 ROS代謝的調節(jié)；ABP9還通過調節(jié)多種逆境/ABA應答相關功能基因（COR15a，KIN1，RD29B等）和調節(jié)基因（CBF1，PP2C，MYB2等）的表達，參與ABA信號傳導和寒冷、干旱、鹽漬等逆境防御反應，從而提高植物耐多種非生物逆境的能力[9-10]。前期研究中，實驗室發(fā)現(xiàn)ABP9可能存在某種特殊的轉錄后調控機制。

植物中瞬時表達系統(tǒng)具有檢測速度快、高通量等特點，結合報告基因GUS[11]、CAT[12]、LUC[13]、GFP[14]、EGFP[15]等使用，該技術被廣泛地用于基因功能分析的研究，如基因表達、蛋白亞細胞定位、啟動子及蛋白活性檢測以及蛋白間互作等[16]。原生質體作為常用的植物瞬時表達系統(tǒng)，是比較均一的單細胞體系；且不需要進行長時間的組織培養(yǎng)，制備檢測過程僅需2 d時間[17]。胡蘿卜、煙草、玉米原生質體瞬時表達系統(tǒng)[18]、土豆[19]、白云衫[20]、大麥[21]、標準的擬南芥瞬時表達系統(tǒng)[22]、優(yōu)化的水稻瞬時表達系統(tǒng)[23]等原生質體瞬時表達系統(tǒng)相繼建立，為研究蛋白的亞細胞定位和基因的表達調控提供了方便而有效的試驗系統(tǒng)。Izawa等利用水稻原生質體瞬時表達系統(tǒng)研究了水稻bZIP類轉錄激活子RITA1對籽粒發(fā)育過程中相關基因的表達調控[24]；Yanagisawa等利用玉米葉片原生質體瞬時表達分析了玉米Dof鋅指蛋白參與組織特異性光調控相關基因的表達[25]；Gu等利用擬南芥原生質體瞬時表達研究了番茄轉錄因子Pti4、Pti5和Pti6在防御應答中的激活作用[26]；李妮娜等建立棉花葉肉原生質體瞬時表達系統(tǒng)，并利用該系統(tǒng)研究了棉花轉錄因子GhZFP2的亞細胞定位[27]。

因此，建立ABP9轉錄因子的玉米原生質體轉化體系對此基因的進一步功能和調控分析和轉基因植株構建具有重要意義。筆者用PEG介導轉化的方法，成功建立了玉米葉肉原生質體較高效的瞬時表達ABP9系統(tǒng)，并利用該系統(tǒng)對轉錄因子ABP9進行了初步分析，以期為進一步闡明ABP9在玉米中的功能及轉錄后調控機制奠定了基礎。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1研究對象。將玉米自交系Qi319飽滿的種子播種于土（蛭石∶泥炭土=1∶1）中，置于培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)2周左右，選取第2片伸展的葉子作為提取玉米原生質體的材料。

1.1.2主要儀器。PCR儀，購自杭州柏恒科技有限公司；Centrifuge 5810R高速離心機和Centrifuge 5804，均購自eppendorf公司；THZC1臺式冷凍恒溫振蕩器，購自太倉市實驗設備廠；DYY6C型核酸電泳儀，購自北京六一化學儀器廠；可控恒溫金屬浴儀，購自金銀杏生物公司。

1.1.3主要試劑。4嗎啉乙磺酸（MES）、纖維素酶R10、離析酶R10、D甘露醇、KCl 、CaCl2、BSA、MgCl2、PEG4000等原生質體提取所用試劑及聚乙二醇辛基苯基醚（Triton X100）、苯甲基磺酰氟（PMSF）、二硫蘇糖醇（DDT）、十二烷基硫酸鈉（SDS）等Western blot所用試劑，均購自Amresco公司；金牌超量無內毒素質粒大提試劑盒，購自北京康為世紀生物科技有限公司；各種限制性內切酶和修飾酶，購自NEB公司；TRIzol reagent購自Invitrogen公司；反轉錄試劑盒，購自北京全式金生物技術有限公司；測序均由北京博艾永華生物科技有限公司完成。

1.2方法

1.2.1亞細胞定位載體構建。pCAMBIA130335SGFPTnos表達框由花椰菜花葉病毒（CaMV）35S啟動子、GFP報告基因、胭脂堿合成酶終止子（NOS）構成。設計2端帶有XbaI和BglII酶切接頭的引物（ABP9XbaIFW：5′gagatctagaatggcgtcggagac3′；ABP9BglIIRV：5′cgtcagatctaccatccacatggcgctg3′，下劃線處為酶切位點）；PCR方法用TransStart FastPfu高保真酶從pCAMBIA3301PubiABP9Tnos載體上擴增目的基因ABP9的cDNA序列，擴增產物回收后雙酶切，經T4 DNA連接酶連接到雙酶切的pCAMBIA130335SGFPTnos載體上，連接產物轉入DH5α感受態(tài)細胞，轉化子經菌落PCR、酶切鑒定以及測序后，獲得ABP9∷GFP融合載體pCAMBIA130335SABP9GFPTnos。按照說明書用金牌超量無內毒素質粒大提試劑盒抽提質粒，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2瞬時表達目的基因載體的構建。瞬間表達載體pUC1935S3FlagTnos的表達框由花椰菜花葉病毒（CaMV）35S啟動子、3Flag標簽、胭脂堿合成酶終止子（NOS）構成；pCAMBIA3301Pabp9 GFPABP9genomicTnos用于制備目的基因片段，二者均由實驗室保存。設計2端帶有XhoI和BstBI酶切接頭的引物（FW：5′ ccgctcgagatggcgtcggagaccacc3′；RV：5′gcttcgaaccacatggcgctgcccgag3′，下劃線處為酶切位點）；用與亞細胞定位載體構建相同的方法將ABP9基因組序列連接到pUC1935S3FlagTnos載體上，構建載體pUC1935SABP9genomic3FlagTnos。

1.2.3玉米原生質體制備。將玉米葉片去兩端切成約0.5 mm細絲，把切好的葉片放入含有酶解液（將1.5%纖維素酶R10，0.4%離析酶R10，0.4 mmol/L D甘露醇，20 mmol/L KCl，20 mmol/L MES（pH 5.7）混合液置于55 ℃水浴10 min，冷卻至室溫后，加入10 mmol/L CaCl2，0.1%BSA，并用0.45 μm濾膜過濾到培養(yǎng)皿中）的培養(yǎng)皿中，室溫黑暗中振蕩（轉速為30 r/min）酶解7 h。使用200目尼龍濾網過濾酶解液，100×g離心2 min，沉淀原生質體。移除上清液，加入預冷的緩沖液W5（2 mmol/L MES（pH 5.7），154 mmol/L NaCl，125 mmol/L CaCl2，5 mmol/L KCl），洗滌沉淀1次，離心后棄上清液，再次加入W5，重懸沉淀，置于冰上30 min。再次100×g離心2 min，棄上清液，加入適量的MMg溶液（4 mmol/L MES，0.4 mmol/L D甘露醇，15 mmol/L MgCl2），備用。

1.2.4PEG介導原生質體轉化。吸取10 μg質粒于2 ml圓底離心管中，加入制備好的200 μl原生質體溶液混勻，加入等體積30%PEGCa2+溶液（30%PEG4000，200 mmol/L甘露醇，100 mmol/L CaCl2），輕輕彈勻后靜置20 min進行誘導。將混合物用W5溶液清洗2次，最后加入1.0 ml W5溶液置于室溫、弱光下培養(yǎng)15 h后收集備用。

1.2.5激光共聚焦顯微鏡觀測。瞬時轉化ABP9∷GFP融合載體的原生質體培養(yǎng)過夜后，用4′，6二脒基2苯基吲哚（DAPI）進行細胞核染色（DAPI儲存液與工作液按1∶1 000稀釋，最終濃度100 ng/ml），染色1 h后用ZEISS激光共聚焦顯微鏡LSM700觀測熒光分布。

1.2.6玉米原生質體總RNA提取及反轉錄PCR。將收集好的原生質體，按照Trizol Reagent說明書提取總RNA，并用1.2%的瓊脂凝膠電泳檢測RNA的完整性，將完整性較好的RNA放于-80 ℃低溫冰箱中備用。將上述提取的原生質體總RNA參照TransScript OneStep gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix試劑盒說明書進行反轉錄，用在線引物設計軟件（http：//www.yeastgenome.org/cgibin/webprimer）設計反轉錄PCR的引物，引物的上下游序列分別為ABP9genomicpureFW：5′ATGGCGTCGGAGACCACC3′和3FlagpureRV：5′ TCACTTATCGTCATCGTC3′。以反轉錄的cDNA為模板，進行PCR擴增，凝膠電泳檢測擴增產物；同時以pUC1935SABP9genomic3FlagTnos為模板，用相同的引物進行PCR作為檢測ABP9在玉米原生質體中轉錄的對照。

1.2.7 Western blot檢測ABP9的表達。分別取100 g未轉化和轉化pUC1935SABP9genomic3FlagTnos的原生質體，加入蛋白提取液（50 mmol/L Tris·Cl（pH 8.0），150 mmol/L NaCl，1% TritonX100，100 μg/ml PMSF）后用移液器吸打，加入上樣緩沖液[50 mmol/L Tris·Cl（pH 6.8），100 mmol/L DTT，2%SDS，0.1%溴酚藍，10%甘油]，高溫變性5 min，經12% SDSPAGE電泳，轉至PVDF膜（聚偏二氟乙烯膜）上，用磷酸鹽吐溫緩沖液（PBST）（137 mmol/L NaCl，2.7 mmol/L KCl，10 mmol/L Na2HPO4，2 mmol/L KH2PO4，0.1%Tween20）溶液洗膜，并用含有5%牛奶的PBST室溫下?lián)u動封閉2 h。滴加抗鼠Flag一抗（1∶5 000）孵育，4 ℃過夜；再次用PBST洗，洗完后加HRP標記的羊抗鼠二抗（1∶5 000）孵育30 min后，PBST洗滌。結果用ECL化學發(fā)光顯色分析，并用x-膠片進行顯影。

2結果與分析

2.1亞細胞定位載體及瞬時表達目的基因載體的構建用于亞細胞定位的載體ABP9∷GFP融合表達載體及瞬時表達ABP9基因載體pUC1935SABP9genomic3FlagTnos通過菌落PCR初步檢測后，酶切篩選陽性克隆，并將陽性克隆進行測序，測序結果經序列比對軟件分析，結果表明插入片段與預期序列完全一致，如圖1所示，表明載體構建成功。

注：a為pCAMBIA130335SABP9GFPTnos載體；b為pUC1935SABP9 genomic3FlagTnos載體。

圖1亞細胞定位載體及瞬時表達目的基因載體構建安徽農業(yè)科學2014年2.2 PEG介導的玉米原生質體的轉化該研究借鑒擬南芥葉肉瞬時表達系統(tǒng)標準方法[22]并進行改進，將誘導劑PEGCa2+的濃度由40%降低到30%，選用暗培養(yǎng)的玉米Qi319兩葉期幼苗為材料，在轉速為30 r/min的水平搖床上酶解7 h，可獲得活力達90%左右的玉米葉肉原生質體。為了提高玉米葉肉原生質體轉化ABP9的效率，對質粒濃度和培養(yǎng)時間等條件進行摸索，綜合原生質體活力及轉化效率考慮，最終得到每管反應體系轉化10 μg質粒，培養(yǎng)15 h，可以使轉ABP9原生質體的轉化效率達50%。

2.3ABP9亞細胞定位分析將構建的亞細胞定位載體pCAMBIA130335SABP9GFPTnos轉化玉米葉肉原生質體，經過DAPI細胞核染色后，用激光共聚焦顯微鏡觀察瞬時表達ABP9∷GFP融合載體的原生質體內熒光分布。如圖2所示，ABP9∷GFP蛋白只出現(xiàn)在細胞核中，由此證明ABP9蛋白定位于細胞核。玉米中，過氧化氫酶基因（CAT）編碼3種同工異構酶CAT1、CAT2和CAT3，共同催化H2O2分解，由此在ROS清除酶系統(tǒng)中占主要部分。ABA應答元件ABRE2位于Cat1的啟動子上，主要參與ABA誘導的Cat1的表達[9-10]。玉米抗逆轉錄因子ABP9是與ABRE2互作從而激活下游報告基因的表達的反式作用因子。該亞細胞定位的結果符合反式作用因子作用特點，證實了ABP9蛋白的核定位調控。

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