苑麗霞　孫毅　楊艷君

摘要[目的] 為了研究不同濃度的Cd2+脅迫對油菜種子的發(fā)芽、生長、葉綠素含量以及超氧化物歧化酶（SOD）活性、過氧化物酶（POD）活性和丙二醛（MDA）含量等生理生化特性的影響。[方法]以3個油菜品種四月慢、100金牌華冠、日本花冠為供試材料，采用砂培法。[結(jié)果] Cd2+脅迫對油菜的發(fā)芽情況、株高、鮮重、SOD活性、POD活性、MDA含量的影響均為極顯著（P<0.01）；低濃度的Cd2+脅迫對油菜的生長有刺激作用，可以提高發(fā)芽率和發(fā)芽勢、株高、鮮重，高濃度的Cd2+脅迫對油菜的生長有抑制作用；當(dāng)Cd2+濃度為0002/L水平時，油菜種子發(fā)芽率、植株的株高、鮮重、葉綠素含量達(dá)到最高值，差異達(dá)到極顯著（P<0.01）；且在3個品種中，100金牌華冠的相應(yīng)值最高，顯著高于另外2個品種（P<0.05）；低濃度的Cd2+脅迫對油菜有刺激作用，可以促進SOD活性、POD活性、MDA含量的提高，高濃度的Cd2+脅迫對油菜的生長有抑制作用；當(dāng)Cd2+濃度為0.01 mg/L時，油菜SOD活性、POD活性達(dá)到最高值，當(dāng)Cd2+濃度為0.02 mg/L時，Cd2+對植物的傷害已超出保護性酶對植物調(diào)節(jié)和保護作用的能力；在3個品種中100金牌華冠的對應(yīng)值最高，也與四月慢和日本花冠2個品種呈顯著差異（P<0.05）；當(dāng)Cd2+濃度為0.005 mg/L水平時，油菜MDA含量達(dá)到最高值，呈極顯著差異（P<001），表明加重了植物體脂質(zhì)過氧化的程度和細(xì)胞損傷的程度。[結(jié)論] 該研究可以為我國煤礦集中地區(qū)農(nóng)田土壤鎘污染的治理以及農(nóng)產(chǎn)品的安全保障提供科學(xué)依據(jù)。

關(guān)鍵詞油菜；鎘脅迫；生理生化特性

中圖分類號S634.3文獻標(biāo)識碼A文章編號0517-6611（2014）09-02544-04

基金項目山西省科技攻關(guān)項目（20110311009）。

作者簡介苑麗霞（1979-），女，山西武鄉(xiāng)人，講師，從事植物生理生化與基因工程方面的研究。*通訊作者，研究員，博士，從事植物生化與基因工程方面的研究。

鎘（Cd）是對人體和植物有毒害作用的重金屬元素之一。在自然界中，鎘多以化合態(tài)存在，常與鋅、鉛等共生。自20世紀(jì)初以來，鎘的產(chǎn)量逐年增加。隨著采礦業(yè)的發(fā)展，相當(dāng)數(shù)量的鎘通過廢氣、廢水、廢渣排入環(huán)境，農(nóng)田土壤Cd污染日趨嚴(yán)重[1]。Cd污染問題已成為威脅土壤生態(tài)安全和制約農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重要因素。植物體內(nèi)富集鎘，通過食物鏈進入人體，引起慢性中毒。不同植物種對鎘吸收和積累存在差異。不同植物種對鎘具有不同的生理生化反應(yīng)[2-3]。油菜作為一種主要的蔬菜被廣泛種植。近來有關(guān)對水稻[4-5]、小麥[6]、 大豆[7]、玉米[8-9]、擬南芥[10]、小白菜[11]、煙草[12]等在鎘脅迫下的生理生化反應(yīng)已有了文獻報道，但對于鎘脅迫下油菜生長發(fā)育中生理生化特性的系統(tǒng)研究還很少。筆者采用室外盆栽試驗，對鎘脅迫下油菜整個生長發(fā)育中生理生化變化過程進行初步研究，旨在篩選油菜鎘污染脅迫的診斷指標(biāo)，并且進一步探討油菜受鎘污染的預(yù)警機制，以期為我國煤礦集中地區(qū)農(nóng)田土壤鎘污染的治理以及農(nóng)產(chǎn)品的安全保障提供科學(xué)依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗材料選用3個油菜品種，分別為四月慢、100金牌華冠和日本花冠小油菜，由山西農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供。

1.2試驗方法選取籽粒飽滿、大小一致、無病蟲害的油菜種子，用濃度0.1% KMnO4消毒15 min，并且用蒸餾水洗凈，晾干后擺放到平鋪3 層濾紙的培養(yǎng)皿中（所用培養(yǎng)皿、濾紙要提前高壓蒸氣滅菌），每皿50粒。各皿分別加入濃度為 0（CK）、0.001、0.002、0.005、0.010、0.020 mg/L 的Cd2+溶液10 ml，以種子濕潤為宜，在（25±1）℃、普通光照條件下培養(yǎng)，以蒸餾水作對照，設(shè)3次重復(fù)。每天定時觀察，種子的胚芽出現(xiàn)則認(rèn)為萌發(fā)，連續(xù)6 d觀察、記錄其發(fā)芽情況，直至蒸餾水對照的發(fā)芽率不再變化為止。

1.3測定方法待油菜幼苗第2片真葉全部展開7 d后（播種后第27天），每隔7 d取油菜植株頂端全部展開的第3葉片測定生理生化指標(biāo)，直至油菜成熟。同時，測定油菜整株生物量（鮮重）和油菜植株莖基部至頂芽的高度表示植株高度。

超氧化物歧化酶（SOD）活性的測定采用氮藍(lán)四唑（NBT）法[14]，用南京建成生物工程研究所的SOD試劑盒測定，利用紫外分光光度計在560 nm波長下測定吸光度，以每毫升反應(yīng)液SOD抑制率達(dá)到50%時所對應(yīng)的SOD量為一個SOD活力單位，單位用U/g表示； 過氧化物酶（POD）活性的測定采用愈創(chuàng)木酚顯色法[15]， 利用紫外分光光度計在470 nm波長下比色，酶活性以每分鐘內(nèi)吸光度A470變化0. 01為一個酶活性單位，單位用U/（min·g）表示；丙二醛（MDA）含量的測定采用TBA （硫代巴比妥酸）法[14]測定，利用紫外分光光度計在532、600、450 nm下測定吸光度值，單位為μmol/g；葉綠素含量測定用濃度95% 酒精浸提研磨葉片，分光光度計（SPECORDS600）比色測定，計算總?cè)~綠素含量，單位為mg/g[7]。

將培養(yǎng)皿放在人工氣候箱中，晝/夜溫度為28℃/25℃，濕度60%，光照強度為134 μmol/（m2·s），以胚根長0.2 mm作為種子發(fā)芽標(biāo)志，在第2～7天統(tǒng)計發(fā)芽種子數(shù)，第7天收獲，并從每個培養(yǎng)皿中取有代表性的5株，測量其根長、芽苗長、芽苗鮮重、根鮮重，并且計算平均值。將收獲的芽苗在液氮中速凍后保存在-80 ℃冰箱中備用。

1.4數(shù)據(jù)處理利用軟件DPS進行統(tǒng)計分析。試驗數(shù)據(jù)用平均值+標(biāo)準(zhǔn)差表示。區(qū)組間數(shù)據(jù)差異進行t檢驗。利用Excel進行數(shù)據(jù)處理與作圖。

2結(jié)果與分析

2.1鎘脅迫對油菜種子萌發(fā)的影響由表1可知，在Cd2+脅迫下，3個品種的油菜種子受到刺激作用，促進油菜種子的萌發(fā)。發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)均隨著Cd2+濃度的升高均呈上升趨勢。與對照相比，當(dāng)Cd2+濃度達(dá)到0002 mg/L時，發(fā)芽率達(dá)到最高值，并且與對照有005水平顯著差異。而后隨著Cd2+濃度的提高轉(zhuǎn)而抑制發(fā)芽，方差分析表現(xiàn)為差異在001水平顯著。同時，3個品種油菜種子的發(fā)芽情況對Cd2+脅迫的耐受能力相當(dāng)，不存在差異。

2.2鎘脅迫對油菜植株生長的影響由圖1、2可知，低濃度的Cd2+脅迫對油菜植株的株高和鮮重都具有刺激效應(yīng)，但隨著Cd2+濃度的增加，轉(zhuǎn)而抑制油菜植株株高和鮮重，且濃度越高，其抑制作用越明顯。與對照相比，當(dāng)Cd2+濃度達(dá)到0.002 mg/L時，對油菜植株株高和鮮重的刺激效應(yīng)最大；當(dāng)Cd2+濃度繼續(xù)升高時，對油菜植株株高與鮮重的增長受到001水平顯著抑制，且隨著濃度的增加其抑制作用逐漸加強。

不同濃度的Cd脅迫對油菜株高的影響圖2不同濃度的Cd脅迫對油菜鮮重的影響安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)2014年2.3鎘脅迫對油菜葉綠素含量的影響植物體內(nèi)的葉綠素與光合作用、氮素營養(yǎng)有密切關(guān)系。由圖3可知，一定濃度的Cd2+脅迫對油菜幼苗期葉片葉綠素的合成具有刺激效應(yīng)，當(dāng)外源Cd2+濃度為0.002 mg/L 時其刺激效應(yīng)最大，但隨著Cd2+濃度的進一步增加轉(zhuǎn)而抑制葉綠素含量的提高。

不同濃度的Cd脅迫對油菜葉綠素含量的影響2.4鎘脅迫對油菜SOD活性的影響由圖4可知，在不同Cd2+濃度下，四月慢、100金牌華冠、日本花冠3個品種SOD活性變化趨于一致，均隨著Cd2+濃度的增加而提高，說明一定量的鎘脅迫會使油菜植株SOD活性提高。當(dāng)Cd2+濃度達(dá)到0.01 mg/L時，油菜SOD活性達(dá)到最大值，而后隨著Cd2+濃度的提高有所下降，且差異達(dá)0.01顯著水平。其中，100金牌華冠在0.01 mg/L Cd2+脅迫下SOD活性最高，并與其他2個品種都有0.05水平顯著差異。

不同濃度的Cd脅迫對油菜SOD活性的影響2.5鎘脅迫對油菜POD活性的影響由圖5可知，與對照相比，隨著Cd2+濃度的增加，不同的油菜品種POD活性逐漸升高，當(dāng)Cd2+濃度達(dá)到0.01 mg/L水平時，POD活性達(dá)到最高，當(dāng)Cd2+濃度達(dá)到0.02 mg/L水平時，POD活性又有下降趨勢。統(tǒng)計分析結(jié)果表明，POD活性隨外源Cd2+濃度的增加與對照組相比差異呈0.01水平顯著。其中，日本花冠在Cd2+濃度為0.02 mg/L脅迫下，POD活性有下降趨勢，但維持在較高水平。

圖5不同濃度的Cd脅迫對油菜POD活性的影響2.6鎘脅迫對油菜MDA含量的影響由圖6可知，當(dāng)外源Cd2+脅迫維持一定水平時，油菜中MDA含量隨著Cd2+濃度的增加而增加，當(dāng)Cd2+濃度為0.005 mg/L水平時，油菜MDA含量達(dá)到最大值，而后隨著Cd2+濃度的提高有所下降，差異在0.01水平顯著。這表明油菜對Cd2+的毒害作用是有一定耐受范圍的。當(dāng)Cd2+濃度達(dá)到0.005 mg/L水平時，3個品種的MDA含量沒有顯著差異。

3結(jié)論與討論

鎘是對人體有害的元素之一。它比其他重金屬易被農(nóng)作物所吸附。相當(dāng)數(shù)量的鎘通過廢氣、廢水、廢渣排入環(huán)境而造成污染。當(dāng)環(huán)境受到鎘污染后，鎘可在生物體內(nèi)富集，通過食物鏈進入人體，引起慢性中毒。所以，近幾年鎘對植物的毒性效應(yīng)被廣泛研究。

Cd2+脅迫能有效地促進植株體內(nèi)生長素（IAA）的生物合成[16]，而IAA能顯著增加植株高度和生物量[17-19]。研究表明，油菜種子發(fā)芽情況均隨著Cd2+濃度的變化而變化，低濃度的Cd2+對油菜發(fā)芽有刺激作用，高濃度的Cd2+能抑制油菜種子的發(fā)芽，且濃度越高抑制作用越明顯。當(dāng)Cd2+濃度達(dá)0002 mg/L時，發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)均達(dá)到最大值。油菜株高、鮮重開始受到抑制的Cd2+濃度為0.005 mg/L，遠(yuǎn)高于油菜種子發(fā)芽率受到抑制的濃度，說明油菜種子發(fā)芽階段對Cd2+的敏感性高于油菜生長后期。有研究表明，當(dāng)Cd2+濃度高于0.002 mg/L時，對油菜植株株高與鮮重的增長有顯著的抑制（P<0.01），且隨著濃度的增加其抑制作用逐漸加強。這表明油菜株高和鮮重的受抑制程度對土壤Cd2+污染程度具有一定的指示作用。

有研究表明，葉綠體合成、光合作用植物生理過程也會受到低劑量的Cd2+的影響而失調(diào)[20]；高濃度的Cd2+會對植物構(gòu)成毒害作用[21]；在鎘脅迫下植物細(xì)胞中活性氧增加，參與對葉綠素的降解[22]，或直接破壞葉綠體微結(jié)構(gòu)，使得葉綠素含量降低[23]。該研究表明，低濃度的Cd2+對油菜葉綠素含量有刺激作用，高濃度的Cd2+能抑制油菜葉綠素含量的積累，且濃度越高抑制效果越明顯。當(dāng)Cd2+濃度達(dá)到0002 mg/L水平時，葉綠素含量達(dá)到最大值。

SOD是植物清除體內(nèi)多余的·O2和H2O2等活性氧的重要酶，對抵御多種理化因子脅迫、減少活性氧積累、維護細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)完整等起著重要作用[24]。該酶的活性在一定程度上隨植物細(xì)胞代謝活動的增強而上升[25]。該研究表明，3種油菜品種的SOD活性均隨著外源Cd2+脅迫濃度的增加而逐漸升高并維持在較高水平，當(dāng)外源Cd2+脅迫濃度達(dá)到0.01 mg/L水平時達(dá)到最大值，隨后SOD活性隨著外源Cd2+脅迫濃度的增加而下降，其中100金牌華冠品種的油菜SOD活性最高。這表明隨著環(huán)境中Cd2+濃度的增加，油菜植株抗逆性逐漸增強，在一定濃度范圍內(nèi)Cd2+脅迫能刺激油菜SOD 活性，激發(fā)油菜植株抵抗逆境的防御機制，且濃度越高刺激效應(yīng)越大；但是，刺激效應(yīng)有一定限度，超出這個限度就會導(dǎo)致油菜SOD 活性急劇降低。過高的Cd2+濃度脅迫已對油菜構(gòu)成毒害作用，致使油菜SOD活性的急劇下降。

POD普遍存在于植物體內(nèi)，在植物的生長、發(fā)育以及植物對環(huán)境的應(yīng)答方面起著重要的調(diào)節(jié)和保護作用[26-27]。該研究表明，3種油菜品種的POD活性均隨著外源Cd2+脅迫濃度的增加而升高，外源Cd2+脅迫濃度為0.01 mg/L水平時達(dá)到最大值，隨后POD活性隨著外源Cd2+脅迫濃度的增加而下降。其中，日本花冠的POD活性在3個品種中雖未達(dá)到最高值，但當(dāng)外源Cd2+脅迫濃度高于001 mg/L水平時仍能持續(xù)在較高水平。這表明油菜在受到外源Cd2+脅迫時，其植株的保護酶POD 活性得到加強，并且激發(fā)植株自身的防御機制，在一定程度上抵制和清除因Cd2+脅迫而引起的對植物構(gòu)成的脂膜過氧化及其他傷害過程；但是，由于它促進植物細(xì)胞壁中半纖維素、果膠質(zhì)等發(fā)生交鏈，形成木質(zhì)素，阻止細(xì)胞伸長，從而抑制油菜植株的生長。

MDA含量可反映機體脂質(zhì)過氧化的程度，間接地反映細(xì)胞損傷程度。該研究表明，油菜葉片MDA含量隨著Cd2+脅迫濃度的提高而急劇增加，外源Cd2+脅迫濃度為0005 mg/L水平時達(dá)到最大值，隨后MDA含量隨著外源Cd2+脅迫濃度的增加而下降。油菜MDA含量受到抑制的Cd2+濃度為0.01 mg/L，遠(yuǎn)低于SOD、POD活性開始受到抑制的濃度0.02 mg/L，說明油菜MDA含量對Cd2+的敏感性高于油菜SOD、POD活性對Cd2+的敏感性。由此可知，油菜MDA含量的抑制程度對土壤Cd2+污染程度具有一定的指示作用。

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