陳燦堅 尹朝暉

結(jié)直腸癌是常見的消化道惡性腫瘤之一，在中國則占據(jù)常見惡性腫瘤的第3～4 位，其發(fā)病率和病死率均有逐年上升的趨勢[1]。由于目前對結(jié)直腸癌的病因和發(fā)病機制尚未完全明了，早期診斷和預(yù)后檢測也不夠完善，因此研究結(jié)直腸癌的早期腫瘤標志物以及探尋以分子生物學為靶點的治療途徑成為熱點，這些研究將有助于對結(jié)直腸癌的早期臨床診斷、指導(dǎo)治療和評價預(yù)后；并且為進一步探討結(jié)直腸癌的發(fā)病機制提供依據(jù)。

精子相關(guān)抗原9(Sperm-associated antigen 9，SPAG 9)是癌睪丸抗原（Cancer-testis antigen，CTA)家族的新成員，在睪丸組織中特異性表達；近年來研究發(fā)現(xiàn)其與多種惡性腫瘤相關(guān)，如腎癌[2]、宮頸癌[3]、子宮內(nèi)膜癌[4]、甲狀腺癌[5]等。SPAG9 作為支架蛋白與c-jun N端激酶(c-jun NH 2-terminal kinase，JNK)相互作用，通過調(diào)節(jié)與之相關(guān)的MAPK組件的信號強度發(fā)揮作用[6-8]，從而調(diào)控人體多種生理功能，并與某些疾病和腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關(guān)；而且JNK已被證實可以促進多種腫瘤細胞的生長[9-10]，推測腫瘤組織高表達SPAG9 蛋白可通過改變MAPK信號通路的強度，促進腫瘤細胞的增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移。目前有關(guān)此基因在結(jié)直腸腫瘤中表達情況的報道尚少，因此本文采用免疫組化法對結(jié)直腸腺瘤、結(jié)直腸癌和結(jié)直腸正常組織SPAG9 蛋白的表達進行檢測，以探討其在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展中的作用及臨床意義。

1 材料與方法

1.1 一般資料 選取2011 年9 月-2013 年2 月汕頭大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院普通外科手術(shù)切除（或結(jié)腸鏡下息肉切除）且經(jīng)病理診斷的結(jié)直腸組織69 例，結(jié)直腸腺瘤18 例，臨床資料完整，其中男48 例，女39 例；年齡30～86 歲，平均年齡60 歲。結(jié)直腸癌病理分級(按WHO標準)：I 級12 例，II 級29 例，Ⅲ級21 例，IV 級7 例，腺瘤18 例；全部病例術(shù)前均未行放、化療。對照組為汕頭大學醫(yī)學院法醫(yī)學教研室切取的意外死亡者正常結(jié)腸組織標本20 例，所有標本均由本院病理科醫(yī)師復(fù)核分級。

1.2 主要試劑 兔抗人SPAG9 多克隆抗體購（Abcam公司，美國），即用型快捷免疫組化MaxVision試劑盒（鼠/兔）和DAB顯色試劑盒（福州邁新生物技術(shù)有限公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 免疫組化采用即用型快捷免疫組化MaxVision法。所有組織均經(jīng)多聚甲醛固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋，切片4 μm厚，脫蠟和水化后，3%過氧化氫溶液處理，PBS沖洗3 次，3 min/次；在EDTA抗原修復(fù)液（PH 8.0）中進行抗原修復(fù)8 min；每張切片加1 滴3%過氧化氫，室溫下孵育10 min，PBS沖洗3 次，3 min/次；除去PBS液，每張切片加1 滴1∶200 稀釋的一抗(兔抗人SPAG9多克隆抗體)，4℃過夜；PBS沖洗3 次，3 min/次；除去PBS液，每張切片加1 滴即用型快捷免疫組化MaxVision試劑，室溫下孵育20 min，BS沖洗3 次，3 min/次；除去PBS液，每張切片加2 滴新鮮配制的DAB，顯微鏡下觀察3～5 min；自來水沖洗，蘇木素復(fù)染，PBS沖洗返藍，DAB顯色，脫水、透明、封片。陽性對照為睪丸組織，PBS代替一抗作陰性對照，其他步驟與待測標本相同。

1.3.2 判斷標準免疫組化結(jié)果采用半定量積分法分析，每例切片選5 個高倍視野，觀察細胞著色百分率和細胞質(zhì)的著色程度，取其均值，按陽性細胞數(shù)占同視野計數(shù)細胞的百分比，≤5%為0 分；5%～25%為1 分；25%～50%為2 分；50%～75%為3 分；75%為4 分。陽性強度以多數(shù)細胞呈色為準，未著色為0 分，淡黃色為1 分，橙褐色為2 分，棕褐色為3 分。兩者相乘0 分為(-)，1～3 分為(+)，4～5 分為(++)，≥6 分為(+++)。

1.4 統(tǒng)計學方法 所有數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0 統(tǒng)計軟件進行處理，組間SPAG9 陽性率用χ2檢驗，方差分析檢驗水準α=0.05，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

SPAG9 在20 例正常結(jié)直腸及69 例癌旁組織中均不表達，而在腺瘤及結(jié)直腸癌標本中高表達，腺瘤表達陽性率77.8%（14/18），結(jié)直腸癌表達陽性率為81.2%（56/69)；SPAG9 在腺瘤與結(jié)直腸癌的表達無統(tǒng)計學意義。SPAG9 蛋白表達主要位于腫瘤細胞膜及胞漿，呈淡黃色或棕褐色，腫瘤間質(zhì)未見明顯表達（見圖1)。SPAG9 的表達與結(jié)直腸癌患者年齡、性別、血清CEA水平、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、組織分級均無明顯的相關(guān)關(guān)系，而與臨床分期有統(tǒng)計學意義，在早期結(jié)直腸癌為I+II(92.7%)、進展期結(jié)直腸癌為III+IV(64.3%)，P＜0.05。表1 示，SPAG9 在腺瘤表達陽性率77.8%（14/18），結(jié)直腸癌表達陽性率為81.2%（56/69)。

圖1 免疫組化檢測ASPAG9 蛋白在結(jié)直腸腺瘤、結(jié)直腸癌（按臨床期別）的表達情況（×200）

表1 SPAG9 表達與結(jié)直腸癌臨床指標的關(guān)系

3 討論

癌睪丸抗原CTA是一類具有特異性表達模式的腫瘤相關(guān)抗原，主要表達于睪丸的生殖細胞、卵子及胎盤的滋養(yǎng)層細胞，近年來研究發(fā)現(xiàn)其在多種腫瘤組織中有不同程度的表達。Zendman等[11]認為其可能參與細胞信號通路傳導(dǎo)、基因轉(zhuǎn)錄及翻譯、染色體重排。在惡性腫瘤組織中，該類抗原的表達與腫瘤細胞的無限增殖、遷移、侵襲能力及遠處轉(zhuǎn)移有關(guān)[12]。

SPAG9 蛋白是CTA家族的一員，SPAG9 編碼的蛋白與JNK相互作用蛋白（JNK interacting protein，JIP）具有結(jié)果同源性，且氨基端有JNK結(jié)合位點，被認為是JIP家族的一員。研究證實，SPAG9 在促分裂素原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路中作為一種支架蛋白與JNK相互作用，通過調(diào)節(jié)與之相關(guān)的MAPKs組件的信號強度發(fā)揮作用[5]，參與人體多種生理作用的調(diào)控，并且在細胞生長、增殖、凋亡和腫瘤發(fā)展中有重要作用。Kanojia[13]在結(jié)腸癌細胞株（COLO 205、HCT 116）和結(jié)腸癌組織中檢測到SPAG9 mRNA和蛋白表達，且70.4%結(jié)腸癌患者血清中出現(xiàn)了SPAG9 的特異性抗體，推測其可能通過MAPK信號通路在結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用。

本實驗發(fā)現(xiàn)SPAG9 在結(jié)直腸腺瘤及結(jié)直腸癌標本中高表達，在正常結(jié)直腸及癌旁組織中均不表達；在早期結(jié)直腸癌表達為I+Ⅱ(92.7%)、進展期結(jié)直腸癌為Ⅲ+Ⅳ(64.3%)，P＜0.05。筆者的數(shù)據(jù)顯示，SPAG9 表達水平在臨床期別的差異有統(tǒng)計學意義。由于癌細胞的侵襲性取決于腫瘤不斷遷徙與侵襲特性，Kanojia[10]通過SPAG 9 SiRNA轉(zhuǎn)染后減少了SPAG9 蛋白表達，致結(jié)腸癌細胞的遷移和侵襲能力顯著下降和改變，減少SPAG9 蛋白在體內(nèi)的表達可以明顯延緩腫瘤的生長，從而證實了SPAG9 在大腸癌的發(fā)生發(fā)展中的潛在作用。本實驗進一步證實SPAG9 在腫瘤的臨床早期階段（Ⅰ和Ⅱ期）表達的密切關(guān)系，表明SPAG9 可能在細胞生長、增殖、細胞遷移、浸潤中扮演一個重要的作用。

其他學者在研究SPAG9 與腫瘤的生物學行為同樣發(fā)現(xiàn)，運用RNA干擾技術(shù)于體外下調(diào)宮頸癌[3]、甲狀腺癌[10]、腎細胞癌[2]等細胞的SPAG9 表達，發(fā)現(xiàn)這些細胞生長受抑制，細胞遷移和侵襲能力下降，其中甲狀腺癌、腎癌細胞的克隆形成能力也下降；此外，用裸鼠進行移植瘤體內(nèi)實驗，發(fā)現(xiàn)SPAG9 基因干擾后，結(jié)腸癌、宮頸癌的腫瘤細胞生長受到明顯抑制[3，10]。雖然上述實驗結(jié)果提示SPAG9 與腫瘤的生物學行為密切相關(guān)，但其機制尚不清楚。氨基酸序列分析揭示了SPAG9 蛋白包含JBD，研究發(fā)現(xiàn)，若將SPAG9 的可讀框第111～934 bp區(qū)域突變，使其缺乏JBD，它就不能參與JNK通路而發(fā)揮作用，這表明SPAG9 是通過JBD與JNK相互作用[14]。JNK家族是促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)超家族成員之一，屬于進化上保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶[15]，JNK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是MAPK通路的一個重要分支，在細胞周期、分化、凋亡、應(yīng)激等多種生理和病理過程中起重要作用。近年來在JNK信號通路中發(fā)現(xiàn)多種潛在的支架蛋白，如JNK連接蛋白JIP、JNK相關(guān)亮氨酸拉鏈蛋白JLP等[16]，這些支架蛋白與JNK及MAPK信號通路中的其他成員相結(jié)合形成復(fù)合物，從而對信號通路的效率及特異性起重要調(diào)節(jié)作用[15]。研究證實，SPAG9 在MAPK信號通路中可能是作為一種支架蛋白通過與JNK的相互作用，參與人體多種生理功能的調(diào)控，并與某些疾病和腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關(guān)[17]。然而，作為JIP家族的新成員，SPAG9 蛋白如何精細調(diào)節(jié)這些信號通路及為何在結(jié)直腸癌早期表達還有待進一步研究。

目前，在許多腫瘤組織中都可檢測到SPAG9 蛋白，該蛋白在乳腺癌[5]、宮頸癌[3]、甲狀腺癌[5]和肺癌[18]組織中的表達率分別為88%（88/100）、82%（54/66）、78%（108/138）和77.78%（21/27）。研究者發(fā)現(xiàn)90%（18/20）的上皮卵巢癌組織[19]中也有SPAG9 蛋白表達，且早期上皮性卵巢癌SPAG9 mRNA的表達率較高。本研究同樣驗證了SPAG9 蛋白的高表達與CRC發(fā)展的早期和晚期階段有顯著密切的關(guān)系（P＜0.003）。由于SPAG9 的潛在作用，作為一種新型的生物標志物，有利于癌癥的早期檢測和診斷。

研究已經(jīng)證實SPAG9 蛋白在許多腫瘤患者中如卵巢癌[19]、腎癌[2]、乳腺癌[5]、宮頸癌[3]可以激發(fā)機體體液免疫反應(yīng)，并在患者血清中檢測到特異性抗體，而針對腫瘤免疫原的抗體進入血液循環(huán)早于抗原，且抗體的量遠遠大于抗原，所以檢測血清中的特異性抗體相對血清抗原而言是具有其獨特的優(yōu)勢，尤其是在腫瘤的早期，更易被檢測，所以SPAG9 蛋白及其血清抗體是更有前景和應(yīng)用價值的腫瘤組織學和血清學標志物。

近年來，針對SPAG9 蛋白的腫瘤疫苗也備受學者關(guān)注，本實驗證實SPAG9 在結(jié)直腸腺瘤及結(jié)直腸癌組織中高表達，且與臨床早期密切相關(guān)，可以作為結(jié)直腸癌的早期檢測和診斷，阻斷SPAG9 表達可能為結(jié)直腸癌的靶向治療提供新的選擇。

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