吳 君，李因剛，柳新紅*，黃有軍，石從廣，陳慶標(biāo)，張少偉

（1. 浙江省林業(yè)科學(xué)研究院，浙江 杭州 310023；2. 浙江農(nóng)林大學(xué)，浙江 臨安 311300；3. 浙江省建德市新安江林場(chǎng)，浙江 建德 311600）

越南安息香大小孢子發(fā)生和雌雄配子體發(fā)育

吳 君1，李因剛1，柳新紅1*，黃有軍2，石從廣1，陳慶標(biāo)3，張少偉3

（1. 浙江省林業(yè)科學(xué)研究院，浙江 杭州 310023；2. 浙江農(nóng)林大學(xué)，浙江 臨安 311300；3. 浙江省建德市新安江林場(chǎng)，浙江 建德 311600）

利用常規(guī)石蠟切片技術(shù)對(duì)越南安息香（Styrax tonkinensis）大小孢子發(fā)生及雌雄配子體的發(fā)育過(guò)程進(jìn)行顯微觀察，結(jié)果表明：越南安息香花藥4室，花藥壁由內(nèi)向外分別為絨氈層、中層、藥室內(nèi)壁和表皮；花藥壁發(fā)育屬于基本型，絨氈層屬于腺質(zhì)型；小孢子母細(xì)胞經(jīng)減數(shù)分裂形成左右對(duì)稱型四分體，胞質(zhì)分裂為同時(shí)型，成熟花粉粒為2-細(xì)胞型，具有3個(gè)萌發(fā)孔；子房3室，胚珠多數(shù)，倒生，具雙珠被，厚珠心，中軸胎座；大孢子母細(xì)胞經(jīng)減數(shù)分裂形成線型四分體，3個(gè)大孢子退化，合點(diǎn)端的1個(gè)發(fā)育成大孢子，胚囊發(fā)育為蓼型；雄蕊發(fā)育早于雌蕊，開(kāi)花后雌雄蕊趨于同熟。

越南安息香；大孢子；小孢子；雄配子體；雌配子體

越南安息香（Styrax tonkinensis）俗稱“東京野茉莉”，屬安息香科安息香屬落葉喬木，為熱帶、亞熱帶陽(yáng)性樹(shù)種?？偁罨ㄐ?，花白色成串，清香，花期4－6月；果實(shí)近球形，果序下垂，果期8－10月[1～3]。越南安息香是集藥用、材用、油用和觀賞等多種價(jià)值于一身的樹(shù)種[4～8]，近幾年引起了研究者的廣泛重視，并從不同角度進(jìn)行了大量研究[9～12]，但有關(guān)其生殖生物學(xué)，特別是生殖生長(zhǎng)發(fā)育方面的基礎(chǔ)性研究未見(jiàn)報(bào)道。本研究以江西吉水種源地的越南安息花芽為試驗(yàn)材料，對(duì)其大小孢子發(fā)生及雌雄配子體發(fā)育進(jìn)行了觀察研究，為越南安息香生殖和發(fā)育生物學(xué)、遺傳育種提供相關(guān)理論基礎(chǔ)，并為安息香科植物的胚胎學(xué)研究提供新資料。

1 材料與方法

1.1 材料與取樣

材料為浙江省林業(yè)科學(xué)研究院苗圃內(nèi)4年生越南安息香試驗(yàn)林（海拔31 m，120°01′ 29″ E，30°13′ 08″ N ），種源地為江西吉水。采樣時(shí)間段為2012年4月11日（出現(xiàn)花芽）至5月13日（花開(kāi)放），2 ～ 3 d采樣1次。在林內(nèi)隨機(jī)選取5株健康植株進(jìn)行采樣，于樹(shù)冠東南西北4個(gè)方向各采若干個(gè)花芽。采樣完畢后立即帶回實(shí)驗(yàn)室，洗凈后放入70% FAA固定液中備用，常溫條件下保存。

1.2 制樣方法

用常規(guī)的石蠟切片法制片，LeciaRM2265輪轉(zhuǎn)式自動(dòng)切片機(jī)連續(xù)切片，厚度為8 ～ 12 μm，番紅—固綠對(duì)染法染色，中性樹(shù)膠封片，顯微鏡Olympus BX60觀察組織切片，Olympus digital camera型相機(jī)拍照。試驗(yàn)于2012年8－11月在浙江農(nóng)林大學(xué)亞熱帶森林培育國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 小孢子發(fā)生及雄配子體發(fā)育

2.1.1 花藥壁發(fā)育 越南安息香為圓錐花序，或漸縮小成總狀花序（圖1-1），每朵花具有4 ～ 10枚花藥，多10枚，同大部分被子植物一樣具有4個(gè)花粉囊（圖1-2）。4月中旬，花芽開(kāi)始萌動(dòng)，此時(shí)形成的小花藥是由一群有高度分裂能力的細(xì)胞組成?；ㄋ幩膫€(gè)角隅分裂速度快，并形成體積大、細(xì)胞質(zhì)濃、核大的孢原細(xì)胞，橫切面上為四棱形，它的最外面分化出一層表皮（圖1-3）。孢原細(xì)胞比其他的細(xì)胞大且分裂快，輻射向增大，經(jīng)一次平周分裂形成初生周緣細(xì)胞（外層）與初生造孢細(xì)胞（內(nèi)層）。初生周緣細(xì)胞再進(jìn)行平周和垂周分裂，產(chǎn)生2層次生周緣層，靠近表皮的一層次生周緣細(xì)胞分化形成藥室內(nèi)壁和中層細(xì)胞，內(nèi)側(cè)一層次生周緣細(xì)胞分化形成中層和絨氈層細(xì)胞。至此，花藥壁分化完成，從外向內(nèi)依次由表皮細(xì)胞（1層）、藥室內(nèi)壁細(xì)胞（1層）、中層（2層）細(xì)胞及絨氈層細(xì)胞（圖1-4）。根據(jù)Davis對(duì)被子植物花藥壁形成方式的劃分，其花藥壁的發(fā)育屬于基本型[13]。

隨著小孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂及花粉粒的形成，花藥壁發(fā)生了一系列變化。越南安息香花粉囊表皮宿存，隨著花藥的發(fā)育而體積增大。藥室內(nèi)壁不發(fā)達(dá)，退化（圖1-5），在整個(gè)花藥發(fā)育過(guò)程中未見(jiàn)藥室內(nèi)壁加厚形成纖維層。中層壁細(xì)胞在花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂時(shí)逐漸解體而被吸收。絨氈層在整個(gè)發(fā)育過(guò)程中原生質(zhì)體始終保持在原位。在花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂期間，絨氈層體積逐漸增大，細(xì)胞質(zhì)進(jìn)一步變濃，細(xì)胞近方形，排列整齊（圖1-6）；四分體時(shí)，有解體現(xiàn)象（圖1-7）；單細(xì)胞時(shí)期，絨氈層細(xì)胞解體明顯（圖1-8）；到花粉成熟，絨氈層完全解體（圖1-9）。可以看出，其細(xì)胞是原位解體，屬于腺質(zhì)絨氈層。

2.1.2 小孢子的發(fā)生 初生造孢細(xì)胞不斷進(jìn)行減數(shù)分裂，發(fā)育形成體積大、細(xì)胞核大的小孢子母細(xì)胞（圖1-10）。小孢子母細(xì)胞經(jīng)過(guò)減數(shù)分裂Ⅰ后，形成2個(gè)細(xì)胞核且不形成細(xì)胞壁（圖1-11、圖1-12）。減數(shù)分裂Ⅱ后，形成四分體，4個(gè)子細(xì)胞共同處于一個(gè)胼胝壁內(nèi)（圖1-13、圖1-14、圖1-15、圖1-16），其胞質(zhì)分裂為同時(shí)型。

2.1.3 雄配子體發(fā)育 隨著胼胝質(zhì)壁溶解，小孢子彼此分開(kāi)，被釋放到花藥腔中。剛從四分體中分離的小孢子細(xì)胞壁薄，細(xì)胞質(zhì)濃，細(xì)胞核大且位于細(xì)胞中央（圖1-18）。隨后小孢子細(xì)胞質(zhì)形成一個(gè)中央大液泡，細(xì)胞核被擠到細(xì)胞邊緣，花粉壁加厚，逐漸成為單核靠邊期小孢子（圖1-19）。此后，小孢子進(jìn)行不均等胞質(zhì)分裂，形成的大的營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞核和小的生殖細(xì)胞（圖1-20）。隨著雄配子體的發(fā)育，生殖細(xì)胞游離在營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞之中。成熟花粉為2-細(xì)胞型，具有3個(gè)萌發(fā)孔（圖1-21）。

2.2 大孢子發(fā)生和雌配子體發(fā)育

2.2.1 胚珠發(fā)育 4月底越南安息香花芽形成雌蕊原基后，生長(zhǎng)分化，形成柱頭、花柱及子房。柱頭三裂（圖

圖1 小孢子發(fā)生及雄配子體發(fā)育

2-1），為濕型柱頭；開(kāi)放型花柱（圖2-2），花柱中有花柱道。子房3室，胚珠多枚（圖2-3），胚珠是由胎座上的胚珠原基發(fā)育而成的，子房?jī)?nèi)表皮下的一些細(xì)胞產(chǎn)生一團(tuán)具有強(qiáng)裂分裂能力的細(xì)胞突起，稱為胚珠原基。（圖2-4）。原基向上生長(zhǎng)，前端發(fā)育成珠心，基部發(fā)育成珠柄，與胎座相連，胚珠生長(zhǎng)時(shí)，珠柄和其他部分的生長(zhǎng)速度并不一致，因此著生方位不同。越南安息香的胚珠為倒生胚珠，整個(gè)胚珠180°扭轉(zhuǎn)，呈倒懸狀。

2.2.2 大孢子發(fā)生 子房發(fā)育早期，其內(nèi)室中央表皮出現(xiàn)一微突起，即為胚珠原基（圖2-4）。隨后珠心表皮下出現(xiàn)1個(gè)體積大、細(xì)胞質(zhì)濃且核大的孢原細(xì)胞（圖2-5）。孢原細(xì)胞進(jìn)行平周分裂產(chǎn)生1個(gè)周緣細(xì)胞和1個(gè)造孢細(xì)胞（圖2-6）。造孢細(xì)胞擴(kuò)大直接發(fā)育成大孢子母細(xì)胞。大孢子母細(xì)胞核大、細(xì)胞質(zhì)濃厚，進(jìn)行減數(shù)分裂。經(jīng)2次減數(shù)分裂后產(chǎn)生4個(gè)單倍體大孢子（圖2-7），近珠孔的3個(gè)細(xì)胞退化，合點(diǎn)端的一個(gè)發(fā)育成功能大孢子（圖2-8）。

2.2.3 雌配子體發(fā)育 雌配子體是由功能性大孢子發(fā)育而來(lái)的。合點(diǎn)端的功能性大孢子繼續(xù)發(fā)育，形成單核胚囊，單核胚囊體積繼續(xù)增大。單核胚囊經(jīng)過(guò)第一次有絲分裂，形成二核胚囊（圖2-9），再經(jīng)過(guò)第二次有絲分裂形成四核胚囊（圖2-10），繼而經(jīng)過(guò)最后一次有絲分裂形成八核胚囊。在成熟的胚囊中可見(jiàn)1個(gè)卵細(xì)胞和2個(gè)助細(xì)胞呈品字形排列，三者合一，稱為卵器。2個(gè)助細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)濃厚，相互排列緊密。在胚囊中央可見(jiàn)中央細(xì)胞的2個(gè)極核相互融合，形成1個(gè)大的次生核。合點(diǎn)端的三核為反足核（圖2-11、圖2-12、圖2-13）。綜上所述，可見(jiàn)越南安息香的胚囊發(fā)育類型屬于蓼型。

圖2 大孢子發(fā)生和雌配子體發(fā)育

2.3 雌雄蕊發(fā)育時(shí)間段對(duì)比 在越南安息香雌、雄蕊發(fā)育過(guò)程中，雄蕊發(fā)育較早，而雌蕊發(fā)育相對(duì)較遲緩，小孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂時(shí)期，雌蕊胚珠原基才處于發(fā)育階段。小孢子四分體時(shí)，大孢子母細(xì)胞才形成。雌蕊后期發(fā)育加快，與雄蕊達(dá)到同熟，見(jiàn)表 1。由此可見(jiàn)，越南安息香的雌雄蕊發(fā)育并不同步。

表1 雌雄蕊發(fā)育時(shí)期

3 結(jié)論與討論

植物的有性生殖對(duì)產(chǎn)生有機(jī)后代和維持物種延續(xù)起絕對(duì)性的作用[14]。越南安息香花藥壁的發(fā)育屬于基本型。從外向內(nèi)依次由表皮細(xì)胞（1層）、藥室內(nèi)壁細(xì)胞（1層）、中層（2層）細(xì)胞及絨氈層細(xì)胞組成。相關(guān)研究中，北柴胡（Bupleurum chinenes）、阿月渾子（Pistacia vera）、楸（Catalpa bungei）[15～17]等大多物種在花粉壁發(fā)育時(shí)，藥室內(nèi)壁會(huì)加厚，最后形成纖維層。而越南安息香的藥室內(nèi)壁在整個(gè)花藥發(fā)育過(guò)程中未見(jiàn)加厚形成纖維層，而是到花粉成熟時(shí)退化。這種現(xiàn)象在紅直獐牙菜（Swertia erythrosticta），川東獐牙菜（Swertia davidii）[18～19]中已有報(bào)道。這可能是由于藥室內(nèi)壁不發(fā)達(dá)造成的，致使藥室內(nèi)壁細(xì)胞在花粉發(fā)育過(guò)程中被完全吸收。越南安息香小孢子母細(xì)胞在減數(shù)分裂中胞質(zhì)分裂為同時(shí)型，產(chǎn)生左右對(duì)稱四分體；成熟花粉為二細(xì)胞型，有3個(gè)萌發(fā)孔。

越南安息香柱頭三裂，濕型柱頭，花柱中有花柱道。子房3室，胚珠多枚，倒生胚珠；雙珠被，厚珠心。成熟的胚囊中2個(gè)助細(xì)胞和1個(gè)卵細(xì)胞呈品字形排列構(gòu)成卵器，中央細(xì)胞的2個(gè)極核在胚囊中央融合，形成1個(gè)大的次生核，合點(diǎn)端的三核為反足核。胚囊發(fā)育屬于蓼型。山礬科與安息香科在親緣關(guān)系上比較密切，研究表明，華山礬（Symplocos chinens）[20]的胚囊發(fā)育也屬于蓼型，這與越南安息香的胚囊發(fā)育相一致。在越南安息香雌、雄蕊發(fā)育過(guò)程中，雄蕊發(fā)育較早，而雌蕊發(fā)育相對(duì)較遲緩，雌蕊后期發(fā)育速度加快，與雄蕊達(dá)到同熟。本研究報(bào)道了越南安息香的雌雄配子體發(fā)育及大小孢子形成，在整個(gè)發(fā)育過(guò)程中未見(jiàn)明顯的異常現(xiàn)象，可為今后系統(tǒng)分類提供有意義的胚胎學(xué)證據(jù)。

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Megasporogenesis, Microsporogenesis and Development of Male and Female Gametophytes in Styrax tonkinensis

WU Jun1，LI Yin-gang1，LIU Xin-hong1*，HUANG You-jun2，SHI Cong-guang1，CHEN Qing-biao3，ZHANG Shao-wei3
（1. Zhejiang Forestry Academy, Hangzhou 310023, China; 2. Zhejiang A & F University, Lin’an 311300, China; 3. Jiande Xin’anjiang Forestry Farm of Zhejiang, Jiande 311600, China）

The megasporogensis, microsporogenesis and development of male and female gametophytes of Styrax tonkinensis were observed by paraffin section technique. The results showed that anthers is 4-sporangiate, and the wall of anther consists of tapetum, middle layers, endothecium and epidermis from inside to out. The development of anther has classified into basic and the tapetum cell is glandular tapetum. The microspore mother cells give rise to isobilateral tetrads by meiosis. Cytokinesis is simultaneous. Mature pollen grain is 2-cell type with three germ pores, with ovaryis trilocular. The ovule is anatropous, bitegmious, crassinucellate axile placenta. The chalazal megaspore in a linear tetrad becomes megaspore. The development of embryo sacs belonges to polygonum type and the stamen was earlier than that of pistil, they synchronized after blossom.

Styrax tonkinensis; megasporogensis; microsporogenesis; male gametophytes; femalegametophytes

S718.43

A

1001-3776（2014）01-0047-05

2013-07-09；

2013-11-10

浙江省省院合作林業(yè)科技項(xiàng)目（2010SY05）；浙江省創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)建設(shè)與人才培養(yǎng)項(xiàng)目（2010F20014）；浙江省重大科技專項(xiàng)重點(diǎn)項(xiàng)目（2008C12019）

吳君（1988－），女，浙江上虞人，碩士生，從事觀賞植物資源研究；*通訊作者。