葉晗迪，周 楊，王廣翔，張培志

（浙江科技學(xué)院 生物與化學(xué)工程學(xué)院，杭州 310023）

HPLC測定鄰苯氨甲基苯酚的氧化降解反應(yīng)

葉晗迪，周 楊，王廣翔，張培志

（浙江科技學(xué)院 生物與化學(xué)工程學(xué)院，杭州 310023）

建立高效液相色譜法（HPLC）測定鄰苯氨甲基苯酚（PMP）氧化降解過程中的質(zhì)量濃度變化。采用Hypersil ODS-C18反向色譜柱（4.6 mm×250 mm，5μm），流動相為甲醇-水（80∶20），檢測波長243 nm，流速1 mL/min，外標(biāo)法定量測定其質(zhì)量濃度。液相測定結(jié)果表明，PMP質(zhì)量濃度在5～100 mg/L范圍內(nèi)，被測溶液質(zhì)量濃度與峰面積呈良好線性關(guān)系，平均加標(biāo)回收率為93.22%～107.62%；試驗精密度RSD=0.20%（n=8），重現(xiàn)性良好。該液相方法可用于鄰苯氨甲基苯酚氧化反應(yīng)的測定。

高效液相色譜；Fenton試劑；鄰苯氨甲基苯酚；氧化降解

氧化N-脫烷基化不僅是藥物和農(nóng)藥代謝的主要途徑，可能涉及各種過氧化物酶或氧化酶，如脂氧合酶、辣根過氧化物酶、細(xì)胞色素P450和胺氧化酶[1]，而且在DNA烷基化損傷修復(fù)中起著重要作用。Fenton反應(yīng)是高級氧化技術(shù)中最重要的反應(yīng)之一。Fenton試劑是雙氧水與亞鐵鹽的混合物[2-3]，它主要是在酸性條件下，通過Fe2+催化分解雙氧水產(chǎn)生·OH，進(jìn)攻有機物分子奪取氫，將大分子有機物降解為小分子化合物或完全氧化為二氧化碳和水等無機物[4-6]。本文報道HPLC法對鄰苯氨甲基苯酚（簡稱PMP，分子結(jié)構(gòu)式見圖1）的檢測及其用于Fenton氧化反應(yīng)的研究。

圖1 PMP分子結(jié)構(gòu)式Fig.1 Structure of PMP

1 試驗部分

1.1 主要儀器及試劑

高效液相色譜儀Waters 1525（美國Waters公司），二極管陣列檢測器Waters 2996（美國Waters公司），SPX-100B-Z生化培養(yǎng)箱等。

PMP自制標(biāo)準(zhǔn)品，經(jīng)過純化處理，純度達(dá)到98.5%以上。

制備標(biāo)準(zhǔn)儲備液：準(zhǔn)確稱取干燥至恒質(zhì)量的PMP標(biāo)準(zhǔn)品0.010 0 g（精確到0.000 1 g），用甲醇超聲溶解并定容至100 mL，配制成質(zhì)量濃度為100 mg/L作為標(biāo)樣儲備液備用。

氧化樣品的制備：在恒溫條件下，將新配制的一定濃度的硫酸亞鐵水溶液與PMP甲醇溶液均勻混合，加入雙氧水作為啟動反應(yīng)并計時。間隔取樣，樣品經(jīng)適量氫氧化鈉溶液中和以終止反應(yīng)。定容，離心處理，上層清液經(jīng)0.45μm有機相濾膜過濾，在色譜條件下測定該時刻Fenton氧化反應(yīng)中PMP的質(zhì)量濃度。

甲醇為色譜純，試驗中使用試劑均為分析純，使用的水為娃哈哈純凈水。

1.2 色譜條件

色譜柱為Hypersil ODS-C18反相色譜柱（4.6 mm×250 mm，5μm），流動相為甲醇-水（80∶20），流速為1 mL/min，檢測波長243 nm，進(jìn)樣量為20μL，柱溫25℃。

1.3 樣品穩(wěn)定性試驗

將PMP標(biāo)準(zhǔn)品溶解于甲醇，在室溫下放置一個月進(jìn)行定期測試，期間未發(fā)現(xiàn)PMP質(zhì)量濃度的變化，說明該化合物性質(zhì)穩(wěn)定，樣品在室溫時中性條件下幾乎不分解。

2 結(jié)果與討論

2.1 檢測波長的選擇

PMP及其主要氧化產(chǎn)物的最大紫外吸收波長分別為243 nm和255 nm，綜合考慮基線、峰形、信號響應(yīng)強弱，以及氧化產(chǎn)物在所選波長下不干擾等因素，選取243 nm為檢測波長，在該波長下PMP響應(yīng)明顯，有利于樣品檢測。

2.2 流動相的選擇

調(diào)整流動相比例，考察不同甲醇∶水比例下的流動相組成對樣品分離的影響。試驗結(jié)果表明，甲醇∶水為80∶20時的峰形及洗脫時間最佳（圖2）。

2.3 工作曲線的建立

精確移取標(biāo)樣儲備液，用甲醇進(jìn)行梯度稀釋，分別配制成質(zhì)量濃度為5、10、20、30、40、50、60、80、100 mg/L的PMP溶液。在上述色譜條件下，按進(jìn)樣量20μL分別進(jìn)樣，將峰面積（y）對質(zhì)量濃度（x）進(jìn)行線性回歸，在質(zhì)量濃度5～100 mg/L范圍內(nèi)，y=59 729.61x+6 624.57，R2=0.999 86，線性良好，精密度RSD=0.20%（n=8）。

圖2 PMP及其氧化產(chǎn)物Fig.2 HPLC chromatograms of PMP and its products

取標(biāo)樣溶液，用甲醇稀釋，測得PMP定量限為5 mg/L，檢測限為1.5 mg/L。

2.4 加標(biāo)回收率試驗

把一定量標(biāo)準(zhǔn)品加入到已知質(zhì)量濃度的氧化樣品中進(jìn)行加標(biāo)回收率試驗，結(jié)果見表1。

2.5 氧化反應(yīng)測定

表1 加標(biāo)回收率測定（n=5）Table 1 Standard recovery of PMP（n=5）

在色譜條件下測定氧化反應(yīng)，以峰面積計算出反應(yīng)物PMP的質(zhì)量濃度，跟蹤不同反應(yīng)時刻氧化反應(yīng)的進(jìn)程。一定質(zhì)量濃度的PMP在25℃，F(xiàn)enton體系中分別反應(yīng)2、4、8、10、14、16、18 h，按試驗方案取氧化樣品進(jìn)行分析，用外標(biāo)法計算樣品中PMP質(zhì)量濃度，降解率分別為49.50%、57.81%、70.75%、75.86%、83.92%、87.73%、89.63%（圖3）。

此外，試驗中溫度改變對PMP氧化反應(yīng)影響明顯。同樣條件下升高反應(yīng)溫度至35℃，反應(yīng)5 h后PMP降解率達(dá)91.25%；在反應(yīng)溫度為40℃時，反應(yīng)4 h后PMP降解率為91.91%?？梢婋S著溫度升高反應(yīng)速率明顯加快。

圖3 PMP不同時刻的降解率Fig.3 Degradation rate of PMP with time change

3 結(jié) 語

本試驗采用高效液相色譜法測定了Fenton試劑作用下PMP的氧化反應(yīng)，該方法具有后處理簡單，操作方便，測定的靈敏度高、準(zhǔn)確性好等特點。此外，試驗發(fā)現(xiàn)，反應(yīng)介質(zhì)的酸性、Fenton試劑中亞鐵及雙氧水的濃度、體系的溫度等均會對氧化反應(yīng)產(chǎn)生較大影響，有關(guān)Fenton試劑氧化N-脫烷基化反應(yīng)的研究將另文報道。

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Determination of 2-((phenylamino)methyl)phenol in oxidative degradation by HPLC

YE Handi，ZHOU Yang，WANG Guangxiang，ZHANG Peizhi
（School of Biological and Chemical Engineering，Zhejiang University of Science and Technology，Hangzhou 310023，China）

A method for determination the oxidative degradation of 2-（（phenylamino）methyl）-phenol was established by HPLC with Hypersil ODS-C18chromatographic column（4.6 mm× 250 mm，5μm），methanol/water（80∶20，V/V）as mobile phase，UV-243 nm as detector and flow rate as 1 m L/min.Experimental results showed that linear relationship and repeatability are good in the range from 5 to 100 mg/L.The recovery is at the range of 93.22%-107.62% and RSD is 0.20%（n=8）.It can be applied to analysis of the reactant concentration in the oxidative reaction.

HPLC；Fenton reagent；2-（（phenylamino）methyl）phenol；oxidative degradation

TQ450.7

A

1671-8798（2014）03-0212-03

10.3969/j.issn.1671-8798.2014.03.010

2014-05-06

國家自然科學(xué)基金項目（31071720）

葉晗迪（1992― ），男，浙江省臺州人，2010級制藥工程專業(yè)本科生。

張培志，教授，主要從事有機化學(xué)及應(yīng)用化學(xué)的教學(xué)和研究。