葉 強，付 昆，彭 成，郭 力（.成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，成都 6007；.成都市第三人民醫(yī)院，成都 6003）

復(fù)方用藥是中醫(yī)藥的特點和優(yōu)勢，是在中醫(yī)藥理論指導(dǎo)下將藥物進行合理的組織，調(diào)其偏性，制其毒性，增強或改變原有功能，消除或緩解其對人體的不良因素，發(fā)揮其相輔相成或相反相成的綜合作用，從而使各具特性的群藥組合成一個新的有機整體的過程[1-2]。炮姜為姜科多年生草本植物姜Zingiber officinale Rosc.的干燥根莖的炮制品，以干姜砂燙至鼓起、表面棕褐色入藥，性溫，味苦、澀，歸脾、肝經(jīng)。炮制后姜的散烈之性已減弱，具有溫經(jīng)止血、溫中止痛的功效[3]?！兑κ霞灧健放c《世醫(yī)得效方》中以附子、炮姜配伍，附子發(fā)揮散寒止痛的功效，并促進炮姜發(fā)揮溫經(jīng)止血、溫中止痛的作用，主治脾虛冷瀉和寒性吐血、便血不止之證[4]。本試驗以附子-炮姜藥對為研究對象，研究配伍前后物質(zhì)基礎(chǔ)的變化，為附子配伍炮姜的傳統(tǒng)理論提供科學(xué)詮釋。

1 材料

1.1 儀器

1200型高效液相色譜（HPLC）儀，含二極管陣列檢測器（DAD）、色譜工作站等（美國Agilent公司）；650型紫外-可見分光光度計（英國Perkins Elmer公司）；BT125D型十萬分之一電子天平（德國Sartorius公司）；R-210/R-215型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（瑞士Buchi公司）；JCD-1036型超聲波震蕩儀（深圳市君馳達(dá)超聲波設(shè)備有限公司）。

1.2 試劑

烏頭堿對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號:0720-200807）；甲醇、乙腈、四氫呋喃為色譜純，水為自制重蒸餾水，其余試劑均為分析純。

1.3 藥材

生附子飲片（產(chǎn)地:四川江油）購自四川江油恒源藥業(yè)有限公司，炮姜（產(chǎn)地:四川犍為）購自成都西部藥業(yè)有限公司，均由成都中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室嚴(yán)鑄云教授鑒定，符合《中國藥典》要求。

2 方法與結(jié)果

附子總生物堿類成分被認(rèn)為是其主要藥效組分，酯型生物堿則被看作毒性組分[5]，故本試驗采用溴甲酚綠染色法測定附子總生物堿、異羥肟酸鐵染色法測定附子酯型生物堿，并結(jié)合HPLC指紋圖譜揭示其總體成分的變化情況。

2.1 附子總生物堿含量測定（溴甲酚綠染色法[6]）

2.1.1 對照品溶液的制備 取烏頭堿對照品約8mg，精密稱定（7.78mg），置于50ml量瓶中，加適量三氯甲烷溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得質(zhì)量濃度為0.1556mg/ml的烏頭堿對照品溶液。

2.1.2 供試品溶液的制備 取附子藥材粗粉約20 g，精密稱定，與炮姜藥材粗粉按1∶0、1∶0.5、1∶1、1∶2（m/m）配伍，分別置圓底燒瓶中，加10倍量水回流提取1 h，濾過，減壓濃縮至100ml，即得。

2.1.3 附子與炮姜按不同比例配伍后的總生物堿含量測定 取上述對照品溶液與供試品溶液，按文獻[6]方法于415nm波長處測定樣品中總生物堿的含量。紫外掃描圖見圖1；標(biāo)準(zhǔn)曲線見表1、圖2；樣品含量測定結(jié)果見表2、圖3。

圖1 烏頭堿溴甲酚綠染色溶液的紫外掃描圖Fig 1 UV scan spectrum of aconitine bromcresol dyeing solution

表1 附子總生物堿含量測定的標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)果Tab 1 Results of standard curves of the content of total alkaloid fromA.carmichaelii

圖2 附子總生物堿含量測定的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig 2 Standard curves of the content of total alkaloid from A.carmichaelii

表2 附子配伍炮姜后總生物堿與酯型生物堿含量測定結(jié)果（%，n＝3）Tab 2 Content determination of total alkaloid and ester alkaloids after compatibility of A.carmichaelii and Zingiber officinale Preparata（%，n＝3）

圖3 附子配伍炮姜后總生物堿的含量變化Fig 3 The change of total alkaloid content after compatibility ofA.carmichaelii and Z.officinale Preparata

從表2、圖3結(jié)果可知，附子與炮姜配伍后附子總生物堿含量大幅度減少，變化范圍為42.29%～50.66%，以附子配伍炮姜（1∶0.5，m/m）降至42.29%為最低。

2.2 附子酯型生物堿的含量測定（異羥肟酸鐵染色法[7]）

2.2.1 對照品溶液的制備 取烏頭堿對照品約20mg，精密稱定（20.4mg），置10ml量瓶中，加少許無水乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得質(zhì)量濃度為2.04mg/ml的烏頭堿對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 同“2.1.2”項下方法制備。

2.2.3 附子與炮姜按不同比例配伍后的酯型生物堿含量測定

取“2.2”項下對照品溶液與供試品溶液，按文獻[7]方法于509nm波長處測定樣品中酯型生物堿的含量。紫外掃描圖見圖4；標(biāo)準(zhǔn)曲線見表3、圖5；樣品含量測定結(jié)果見表2、圖6。

從表2、圖6結(jié)果可知，附子與炮姜配伍后附子酯型生物堿含量降幅較大，變化范圍為29.91%～47.54%，以附子配伍干姜（1∶1，m/m）降至29.51%為最低。

2.3 附子與炮姜配伍的HPLC指紋圖譜研究

圖4 烏頭堿異羥肟酸鐵染色溶液的紫外掃描圖Fig 4 UV scan spectrum of aconitine ferric hydroxamate dyeing solution

表3 附子酯型生物堿含量測定的標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)果Tab 3 Rusults of standard curves of the content of ester alkaloids fromA.carmichaelii

圖5 附子酯型生物堿含量測定的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig 5 Standard curves of the content of ester alkaloids from A.carmichaelii

圖6 附子配伍炮姜后酯型生物堿的含量變化Fig 6 The change of ester alkaloids content after compatibility ofA.carmichaelii and Z.officinale Preparata

由于中藥材成分相當(dāng)復(fù)雜，因此在進行了附子總生物堿和酯型生物堿研究的基礎(chǔ)上，筆者進一步采用HPLC指紋圖譜，從宏觀方面研究藥材配伍的物質(zhì)基礎(chǔ)變化情況。為使試驗條件統(tǒng)一、可控，選擇附子-炮姜（1∶1，m/m）藥對作為研究對象，其他比例將在以后進行研究。

2.3.1 色譜條件色譜柱:Dikma Dianonsil C18（250mm×4.6mm，5 μm）；流動相:乙腈-四氫呋喃（25∶15，V/V）（A）-0.1 mol/L醋酸銨溶液（B），梯度洗脫（洗脫程序見表4）；檢測波長:230nm；流速:1ml/min；柱溫:30 ℃；分析時間:70min。

表4 梯度洗脫程序Tab 4 Gradient elution

2.3.2 供試品溶液的制備 分別取附子、炮姜粗粉各約5 g，精密稱定，再取附子-炮姜（1∶1，m/m）配伍粗粉約10 g，精密稱定，分別置具塞錐形瓶中，加氨試液3ml、異丙醇-乙酸乙酯（1∶1，V/V）混合溶液50ml，稱定質(zhì)量，超聲處理（功率:120 W，頻率:40～60 kHz）30min，放冷，再稱定質(zhì)量，用異丙醇-乙酸乙酯（1∶1，V/V）混合溶液補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過。精密量取續(xù)濾液25ml，40℃以下減壓回收溶劑至干，殘渣精密加入異丙醇-乙酸乙酯（1∶1，V/V）混合溶液3ml使溶解，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3.3 附子、炮姜單味藥材與藥對的指紋圖譜研究 按文獻[8]方法進行指紋圖譜研究，詳見圖7。

圖7 附子-炮姜藥對的HPLC指紋圖譜A.配伍溶液（1∶1，m/m）；B.附子單煎；C.炮姜單煎Fig 7 HPLC fingerprintingA.compatible solution（1 ∶1，m/m）；B.single herb decoction of A.carmichaelii；C.single herb decoction of Z.officinale Preparata

從圖7可知，附子藥材主要的特征色譜峰有7個，炮姜有4個，配伍后均可檢測到。但是，配伍后有的附子的成分增多了，有的減少了。因此，為了更好地說明附子成分變化的情況，筆者以加權(quán)變化率對其進行測定。將附子的7個峰按峰面積進行加權(quán)，按下列公式計算其加權(quán)變化率，以判斷其成分總體的變化狀況。附子配伍炮姜后附子各成分的加權(quán)變化率見表5。

表5 附子配伍炮姜后附子各成分的加權(quán)變化率Tab 5 Percentage of weighting change of each component in A.carmichaelii after combined with Z.officinale Preparata

由表5可知，附子與炮姜配伍后，附子各成分總加權(quán)變化率為81.00%，說明總體上附子成分有所減少。

3 討論

3.1 配伍比例

臨床配伍時常常遵循特定的藥物用量比例，比例不同藥效也會不同[9]。附子與炮姜的配伍比例在文獻中未見詳細(xì)記載，故筆者借鑒附子與干姜、生姜的傳統(tǒng)配伍規(guī)律（大多為1∶1，m/m），選用1∶0.5、1∶1、1∶2三個質(zhì)量比進行研究。

3.2 總生物堿與酯型生物堿

附子與炮姜配伍使附子總生物堿含量減少了約一半，總堿變化范圍為42.29%～50.66%，表明加入炮姜能減少附子有效成分的溶出，從而降低附子辛熱之性，其回陽救逆和補火助陽的作用被抑制，進而使其發(fā)揮溫經(jīng)、散寒除痹的功效；附子配伍炮姜使附子酯型生物堿含量大幅減少，酯型生物堿變化范圍為29.51%～47.54%，表明加入炮姜能降低附子的毒性。

3.3 指紋圖譜

指紋圖譜能夠提供較為全面的信息，可以比較全面、綜合地從宏觀上對復(fù)方配伍的物質(zhì)基礎(chǔ)進行分析。通過附子-炮姜藥對與其單味藥材的指紋圖譜比較可以看出，其物質(zhì)基礎(chǔ)在配伍前后發(fā)生了明顯變化。本試驗采用加權(quán)變化率指標(biāo)對配伍前后附子主要成分進行了總體評價，發(fā)現(xiàn)附子與炮姜配伍后，附子成分總體減少為原來的81.00%。從另一個方面也表明，附子與炮姜配伍后，能減少附子成分的溶出，有利于抑制附子辛熱之性，發(fā)揮其溫經(jīng)、散寒除痹的作用，與炮姜共奏溫經(jīng)止血之功。

3.4 傳統(tǒng)理論

《本草崇原》[10]有如下論述:“《神農(nóng)本草經(jīng)》止有生姜、干姜，而無炮姜，后人以干姜炮黑，謂之炮姜?！薄督饏T要略》治肺痿用甘草干姜湯，其干姜亦炮，是炮姜之用，仲祖其先之矣。姜味本辛，炮后辛味稍減，散烈之性已減弱，具有溫經(jīng)止血的功效[11]。附子與炮姜配伍使附子總堿、酯型生物堿、雙酯型生物堿均有較大降幅，附子不致太過辛熱、耗氣傷陰，從而發(fā)揮其溫經(jīng)、散寒、止痛的作用，可主治產(chǎn)后血虛身熱，及寒性吐血、衄血、便血之證。

[1]彭成.中藥藥性理論的科學(xué)基礎(chǔ)[R].北京:中華中醫(yī)藥科技成果論壇專題報告，2004:3.

[2]李克光.金匱要略講義[M].上海:上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1991:45.

[3]張谷才.仲景方劑學(xué)[M].上海:上海中醫(yī)藥大學(xué)出版社，2008:33.

[4]胥慶華.中藥藥對大全[M].北京:中國中醫(yī)藥出版社，1996:3-89.

[5]陳信義，李峨，侯麗，等.烏頭類生物堿研究進展與應(yīng)用前景評述[J].中國中醫(yī)藥信息雜志，2004，11（10）:922.

[6]葉強.附子配伍大黃調(diào)控藥性物質(zhì)基礎(chǔ)研究[D].成都:成都中醫(yī)藥大學(xué)，2005.

[7]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典:一部[S].2005年版.北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2005:122-123.

[8]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典:一部[S].2010年版.北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010:177-178.

[9]由鳳鳴，葉俏波，李晨光.附子功效發(fā)揮方向的配伍控制分析[J].江西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2010，22（1）:63.

[10]（清）張志聰.本草崇原[M].北京:中國中醫(yī)藥出版社，2008:1139.

[11]（元）危亦林.世醫(yī)得效方[M].北京:中國中醫(yī)藥出版社，2009:268.