徐 軍，王國恩，章時杰，何蓉蓉，栗原博，秦書儉

（1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，遼寧沈陽 110032；2.暨南大學(xué)中藥及天然藥物研究所，廣東廣州 510632；3.廣州中醫(yī)藥大學(xué)臨床藥理所，廣東廣州 510405）

據(jù)2013年報道的一項流行病學(xué)統(tǒng)計，非酒精性脂肪肝（non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）在中國的患病率達到15%，并呈現(xiàn)逐年增加的趨勢。報告還指出，約27%城市人口的肝臟脂肪變性（he-patic steatosis）與肥胖及代謝綜合征相關(guān)［1］。隨著人類肥胖癥發(fā)生率的增加，NAFLD成為威脅人類健康的重要疾病之一。NAFLD根據(jù)病情分為單純性脂肪肝、脂肪性肝炎、脂肪性肝纖維化、脂肪性肝硬化及肝癌變。單純性脂肪肝是早期NAFLD的臨床表現(xiàn)，其臨床特點是肝臟脂肪變性，表現(xiàn)為甘油三酯蓄積［2］。Theacrine，即 1，3，7，9-四甲基尿酸，是我課題組從云南省金平縣山區(qū)生長的野生植物Camellia assamica var.kucha Chang et Wang中分離并大量制備的甲基黃嘌呤類生物堿，其分子式為C9H12N4O3，結(jié)構(gòu)式見Fig 1。其可溶于氯仿、乙醇，微溶于水，并具有良好的熱穩(wěn)定性。我們在前期實驗中發(fā)現(xiàn)其有較好的促進脂肪酸代謝的作用。文獻報道，其結(jié)構(gòu)類似物caffeine在臨床上表現(xiàn)出良好的預(yù)防NAFLD的作用，同時也表現(xiàn)出提高能量代謝的作用［3-4］。而與caffeine相比，theacrine的中樞興奮副作用較弱［5］。因此，本實驗研究嘌呤生物堿theacrine對高脂飲食小鼠肝臟甘油三酯蓄積的影響，并進一步探討其作用機制。

Fig 1 Chemical structure of theacrine

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器 Theacrine是從植物苦茶（Camellia assamica var.kucha Chang et Wang）中分離、純化得到的單體化合物，純度大于98%（HPLC分析）；標(biāo)準(zhǔn)飼料（玉米粉39.75%，酪蛋白20%，麥芽糖糊精 13.2%，蔗糖 10%，豆油 7%，纖維素5%，混合礦物質(zhì)3.5%，混合維生素 1%，L-胱氨酸0.3%，氯化膽堿 0.25%），高脂飼料（玉米粉8.6%，酪蛋白 23.6%，麥芽糖糊精 11.8%，蔗糖20.4%，豆油 2.9%，纖維素 5.9%，混合礦物質(zhì)4.1%，混合維生素1.2%，L-胱氨酸0.4%，氯化膽堿0.3%，豬油20.9%）（購自廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心）；TG測定試劑盒（北京北化康泰臨床試劑有限公司）；蘇丹IV（上海試劑三廠）；蘇木精（Sigma公司）；伊紅（上海國藥集團化學(xué)試劑有限公司）；BCA蛋白含量檢測試劑盒（賽默飛公司）；IP裂解液（碧云天公司）；兔抗 Sirtuin 3（SirT3）、電壓依賴陰離子通道（VDAC）、AMP活化蛋白激酶α（AMPK）、磷酸化AMPK（pAMPK）（Thr172）、乙酰輔酶A羧化酶（ACC）、磷酸化 ACC（pACC）（Ser79）抗體（CST公司）；山羊抗兔IgG（聯(lián)科生物有限公司）。MK3型酶標(biāo)儀（芬蘭Labsystem公司）；Leica RM2235型石蠟切片機、Leica CM1950型冰凍切片機（日本島津公司）；Olympus BX50型光學(xué)顯微鏡、CW4000 FISH Olympus拍照系統(tǒng)（日本奧林巴斯公司）；電泳槽、電轉(zhuǎn)槽（Bio-Rad公司）；電泳儀（北京市六一儀器廠）；ECL試劑盒（聯(lián)科生物有限公司）；4.6.2版Quantity One圖像分析軟件。

1.2 動物分組及處理 3周齡的♂C57 BL／6J小鼠購自廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心，許可證號為SCXK（粵）2008-0002。動物隨機分為標(biāo)準(zhǔn)飲食組和高脂飲食組，分別喂養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)飼料和高脂飼料。喂養(yǎng)11周后，高脂飲食組小鼠體重明顯高于標(biāo)準(zhǔn)飲食組。高脂飲食組小鼠按體重進行篩選，取體重相近的小鼠隨機分為3組，每組8只，組間體重差異無顯著性（P＞0.05），分別是HFD組、theacrine低劑量組（10 mg·kg-1，HFD+TL）、theacrine高劑量組（20 mg·kg-1，HFD+TH）。其中，theacrine給藥溶液以蒸餾水配制，以10 ml·kg-1的體積灌胃。標(biāo)準(zhǔn)飲食組隨機選出8只設(shè)為正常對照（ND）組。實驗組每天給藥1次，連續(xù)給藥6周，ND和HFD組給予等量的蒸餾水。最后一次給藥后，用乙醚麻醉小鼠，迅速取出肝臟，切取約1 cm3部分置于4%多聚甲醛中固定。取約100 mg肝組織置于杜恩斯勻漿器中，加入冰冷的細胞裂解液，于冰上勻漿2 min，并于冰上靜置 10 min，離心（12 000 r·min-1，4℃）10 min，取出上清液用于Western blot分析。其余貯存在-80℃冰箱中。

1.3 細胞培養(yǎng)及處理 HepG2細胞（來源于ATCC）加入含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基，置于37°C、飽和濕度5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取單層培養(yǎng)的HepG2細胞，用胰酶消化，并以每孔4×105個接種于6孔板中。待細胞貼壁后，加入compound C對細胞進行預(yù)處理30 min，然后加入theacrine孵育24 h。具體實驗安排：正常對照組（不加任何處理）；compound C組（只加入終濃度為15μmol·L-1的 compound C處理24 h）；theacrine組（只加入終濃度為2 mmol·L-1的 theacrine處理24 h）；theacrine+compound C組（加入終濃度為15μmol·L-1的 compound C及2 mmol·L-1的 theacrine共同處理24 h）。其中，compound C給藥溶液用DMSO配制成5 mmol·L-1的母液，theacrine給藥溶液用含10%胎牛血清的RPMI 1640配制成16 mmol·L-1的母液。最后收集細胞，加入冰冷的細胞裂解液，冰上靜置 10 min，離心（12 000 r·min-1，4℃）10 min，取出上清液用于Western blot分析。

1.4 肝臟TG含量測定 取肝臟同一部位，以生理鹽水勻漿制備10%勻漿液，離心（3 000 r·min-1，4℃）10 min。取上清液，使用甘油-3-磷酸激酶氧化法（GK-GPO），經(jīng)酶標(biāo)儀分析測定TG含量。

1.5 組織學(xué)觀察 固定后的肝組織常規(guī)石蠟包埋，切片，厚3μm，HE染色。取新鮮肝臟進行冰凍切片，厚4μm，用蘇丹IV和蘇木精分別染脂質(zhì)和細胞核，并在顯微鏡下觀察組織脂肪蓄積程度。

1.6 Western blot分析 上清液采用BCA蛋白含量檢測試劑盒測定蛋白濃度。約6 g·L-1蛋白樣品以4∶1加入5×蛋白上樣緩沖液，混合后置于沸水浴5 min進行蛋白變性。制備10%的聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）后，對蛋白含量調(diào)成等量的樣品進行電泳。用電轉(zhuǎn)印法將電泳條帶轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，并對膜上非特異性抗原封閉2 h以上。依次與SirT3（1∶3 000）、VDAC（1∶2 000）、AMPK（1∶2 000）、pAMPK（1∶3 000）、ACC（1∶1 000）、pACC（1∶1 000）等抗體室溫孵育4 h，用TBST洗滌3次，再與山羊抗兔IgG（1∶2 000）室溫孵育1.5 h，用TBST洗滌3次，最后用ECL試劑盒進行化學(xué)發(fā)光顯影，用Quantity One圖像分析軟件分析。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理 實驗數(shù)據(jù)以ˉx±s表示，采用SPSS13.0軟件，利用ANOVA檢驗和 Dunnett’s檢驗進行統(tǒng)計學(xué)處理。

2 結(jié)果

2.1 Theacrine對高脂飲食小鼠肝臟中甘油三酯水平的影響 如Fig2所示，與標(biāo)準(zhǔn)飲食組小鼠相比，高脂飲食模型組小鼠肝臟中甘油三酯含量明顯增加

Fig 2 Effects of theacrine on hepatic TG content（n＝8）**P＜0.01 vs ND group；##P＜0.01 vs HFD group

（P＜0.01），而theacrine能呈劑量相關(guān)地降低高脂飲食小鼠肝臟中甘油三酯的水平（P＜0.01）。

2.2 Theacrine對高脂飲食小鼠肝組織病理學(xué)的影響 如Fig 3A所示，高脂飲食小鼠肝臟門管區(qū)及小葉間靜脈周圍的脂質(zhì)含量明顯多于標(biāo)準(zhǔn)飲食組，高脂飲食導(dǎo)致了脂肪變性狀態(tài)的出現(xiàn)。Theacrine呈劑量相關(guān)地減輕了小鼠肝臟中脂肪蓄積狀態(tài)，且高劑量作用明顯。從Fig 3B可以發(fā)現(xiàn)，標(biāo)準(zhǔn)飲食小鼠肝臟的肝小葉結(jié)構(gòu)完整，高脂飲食小鼠肝臟的門管區(qū)及小葉間靜脈周圍的脂肪空泡明顯增多，高、低劑量的theacrine均能減少肝組織切片中脂肪空泡。結(jié)果表明，theacrine改善了高脂飲食誘導(dǎo)的小鼠肝臟脂肪化。

Fig 3 Histological analysis of hepatic tissue from different groups with Sudan IV（A）or H＆E（B）staining

2.3 Theacrine對小鼠肝臟中蛋白表達的影響 與正常組相比，長期高脂飲食導(dǎo)致肝臟脂肪變性，其肝臟線粒體中 SirT3的蛋白表達減少（P＜0.05），AMPK的磷酸化水平明顯降低（P＜0.01），而ACC蛋白的磷酸化也有一定程度的減少。Theacrine呈劑量依賴地提高了小鼠肝臟中SirT3的蛋白表達以及AMPK、ACC蛋白的磷酸化水平（P＜0.05，P＜0.01）。結(jié)果表明，theacrine能激活 SirT3、AMPK，增加ACC的磷酸化，使ACC活性減弱，最終抑制脂肪酸的合成。見Fig 4。

Fig 4 Protein expression of Sir T3 and phosphorylation ofAMPK and ACC in different groups*P＜0.05，**P＜0.01 vs ND group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs HFD group

Fig 5 Effects of theacrine on protein expression of Sir T3 and phosphorylation of AMPK and ACC in Hep G2 after AMPK was inhibited by compound C

2.4 Theacrine對AMPK抑制后細胞內(nèi)相關(guān)蛋白表達的影響 如Fig 5所示，與正常細胞相比，給予2 mmol·L-1theacrine孵育24 h后細胞內(nèi)SirT3的蛋白表達及AMPK和ACC的磷酸化作用均增加。在AMPK抑制劑15μmol·L-1compound C作用后，SirT3的蛋白表達不變，而ACC的磷酸化水平下降。當(dāng)給予theacrine孵育后，ACC的磷酸化作用仍受到抑制，而SirT3的蛋白表達卻有了增加。以上結(jié)果顯示，theacrine導(dǎo)致SirT3的激活不依賴于AMPK的激活，而ACC磷酸化的增加依賴于AMPK的激活。

3 討論

單純性脂肪肝是早期非酒精性脂肪肝的臨床表現(xiàn)，其臨床特點是出現(xiàn)肝臟脂肪變性，不見或少見炎癥浸潤和局部壞死，即“初次打擊”［6］。肝臟脂肪變性主要是由于肝臟對營養(yǎng)物質(zhì)的過量攝取，部分能量轉(zhuǎn)為貯存，加速了脂肪酸的合成，最終合成甘油三酯，并在肝臟中蓄積。肝臟中脂肪酸合成的限速酶ACC能使乙酰輔酶A羧化形成丙二酰輔酶A。ACC的活化受到上游AMPK的調(diào)節(jié)。人們知道，AMPK是調(diào)節(jié)能量代謝的重要蛋白，其在脂肪酸代謝方面起到重要調(diào)節(jié)作用。AMPK的磷酸化能增加ACC的磷酸化，而導(dǎo)致ACC的失活，進而減少脂肪酸的合成，改善肝臟脂肪變性［7］。已有文獻報道，caffeine能激活A(yù)MPK，從而改善HepG2細胞的脂質(zhì)沉積［8］。我們的研究發(fā)現(xiàn)，caffeine結(jié)構(gòu)類似物theacrine能減少高脂飲食小鼠肝臟中脂質(zhì)的合成和蓄積，改善高脂飲食小鼠肝臟脂肪化，對小鼠早期NAFLD狀態(tài)有緩解作用。此外，實驗中我們觀察到高脂飲食小鼠的肝臟中AMPK的磷酸化水平明顯降低，在持續(xù)6周給予theacrine作用后，小鼠的肝臟中AMPK及ACC的磷酸化水平明顯提高。體外實驗也發(fā)現(xiàn)，theacrine能激活 HepG2細胞內(nèi) AMPK、ACC產(chǎn)生磷酸化作用。這提示theacrine的改善作用可能依賴于AMPK的激活。近年來，人們發(fā)現(xiàn)了線粒體中去乙?；窼irT3在能量代謝中起到重要的調(diào)節(jié)作用［9］。Shi等［10］的研究發(fā)現(xiàn)，SirT3能增加AMPK的磷酸化并激活A(yù)CC產(chǎn)生磷酸化作用，減少丙二酰輔酶A的合成，進而減少脂肪酸合成，緩解肝細胞中甘油三酯的蓄積。我們的研究發(fā)現(xiàn)，抑制AMPK磷酸化作用后，theacrine能增加SirT3的蛋白表達卻不能增加ACC的磷酸化。這說明了theacrine對SirT3的激活不依賴于AMPK的激活，而對ACC的磷酸化依賴于AMPK的激活。這提示theacrine可能通過激活SirT3／AMPK／ACC通路減少ACC活性，進而減少脂肪酸合成，抑制肝臟甘油三酯的蓄積，改善高脂飲食小鼠肝臟脂肪化狀態(tài)。

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