宋必衛(wèi)，樊俏玫，何治宇

（浙江工業(yè)大學(xué)藥學(xué)院，浙江 杭州 310014）

calpains是一類由 Ca2+激活的內(nèi)源性中性半胱氨酸蛋白酶，幾乎存在于所有哺乳動物細(xì)胞中。自首次在鼠大腦組織中發(fā)現(xiàn)calpain以來，人類對calpains的研究已超過半個世紀(jì)。calpains通過Ca2+激活和自溶而表現(xiàn)出蛋白水解酶活性，并被內(nèi)源性抑制劑calpastatin所抑制，可參與細(xì)胞骨架重構(gòu)、細(xì)胞分化、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、胚胎發(fā)育以及調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)釋放等多種生理活動。近年來研究發(fā)現(xiàn)calpains還參與細(xì)胞凋亡過程［1］，但其具體的調(diào)控機制仍不十分清楚。線粒體是細(xì)胞凋亡發(fā)生的關(guān)鍵細(xì)胞器，可以儲存鈣離子，控制細(xì)胞中鈣離子濃度的動態(tài)平衡。盡管先前研究認(rèn)為calpains是一種胞質(zhì)酶，近年來研究發(fā)現(xiàn)某些calpains也同時存在于線粒體中，線粒體calpains可參與細(xì)胞凋亡調(diào)控過程。本文對線粒體calpains的活性調(diào)節(jié)以及調(diào)控細(xì)胞凋亡的作用機制予以綜述。

1 calpains的分類和結(jié)構(gòu)

calpains家族根據(jù)其組織分布分為兩大類［2］：一類是特異性 calpains，包括calpain 3（骨骼?。?、calpain 8（平滑?。alpain 9（胃）等；另一類是非特異性 calpains，包括calpain 1、2和10等。另外，根據(jù)功能區(qū)IV結(jié)構(gòu)不同，分為典型和非典型 calpains，典型 calpains（1、2、3、8、9、11、12和 14）在功能區(qū) IV含有 EF-手結(jié)構(gòu)，而非典型 calpains（5、6、7、10、13和15）則缺乏此區(qū)。其中最有代表性的calpains是 μ-calpain（calpain 1）和 m-calpain（calpain 2），它們是由80 ku的催化亞基和28 ku的調(diào)節(jié)亞基組成的二聚體［3］，區(qū)別在于體外激活所需Ca2+濃度不同，激活μ-calpain需要2～80μmol·L-1Ca2+，而 m-calpain需要0.2～0.8 mmol·L-1Ca2+。

多數(shù)calpains催化亞基包含4個功能區(qū)（功能區(qū)Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ）［4］。μ-calpain和 m-calpain的功能區(qū)Ⅰ于 Ca2+激活后被剪切，而calpain 10在該功能區(qū)含有線粒體定位序列，不會發(fā)生自溶；功能區(qū)Ⅱ是由半胱氨酸（Cys）、天冬氨酸（Asp）和組氨酸（His）組成催化三聯(lián)體的活性中心；功能區(qū)Ⅲ含有兩個Ca2+結(jié)合位點以及磷脂結(jié)合域，與底物識別有關(guān)，可通過靜電相互作用調(diào)節(jié)calpain的活性，但calpain 10不含此區(qū)域；功能區(qū)Ⅳ含有EF-手結(jié)構(gòu)，可結(jié)合Ca2+、calpastatin、小亞基（calpain4），而非典型calpains則缺乏此區(qū)，不能結(jié)合小亞基及calpastatin。calpain 4是分子質(zhì)量為28 ku的小亞基，作為調(diào)節(jié)亞基與典型calpains（催化亞基）構(gòu)成二聚體。

2 線粒體calpains的活性調(diào)節(jié)

盡管calpains被認(rèn)為是一類胞質(zhì)酶，最近研究發(fā)現(xiàn)μcalpain、m-calpain、calpain10以及內(nèi)源性抑制劑calpastatin也同時存在于線粒體中［5］。細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的升高在凋亡早期信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及凋亡執(zhí)行階段發(fā)揮著重要作用，Ca2+絡(luò)合劑BAPTA-AM可抑制細(xì)胞凋亡［6-7］。線粒體作為胞內(nèi)的鈣庫之一，是決定細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵細(xì)胞器，不同病理生理條件下線粒體Ca2+超載會引發(fā)一系列不可逆細(xì)胞損害。線粒體Ca2+在質(zhì)子電化學(xué)梯度驅(qū)動下由釕紅敏感的單向轉(zhuǎn)運蛋白攝取，主要通過 Na+／Ca2+交換蛋白（NCX）外流。［Ca2+］i升高引起［Ca2+］m的提高，故胞質(zhì)［Ca2+］i超載可致線粒體異常與細(xì)胞功能紊亂。［Ca2+］i的升高激活calpain，通過限制性蛋白水解作用降解胞內(nèi)蛋白。另外，通過自溶及與磷脂的作用可以降低calpains激活所需Ca2+濃度。

線粒體的μ-calpain受蛋白二硫化物異構(gòu)酶（PDI）家族成員ERp57調(diào)節(jié)，但胞質(zhì)的μ-calpain和m-calpain與ERp57無關(guān)。ERp57（也稱為 ER-60，ERp60，ERp61，GRp58）首先被發(fā)現(xiàn)于大鼠肝臟內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER），也存在于線粒體外膜。ERp57的功能與錯誤折疊的二硫鍵的糖蛋白的糾正和重排有關(guān)［8］，線粒體膜間隙蛋白由于氧化作用需要形成二硫鍵及功能性構(gòu)象，ERp57使線粒體μ-calpain大亞基發(fā)生重折，形成二硫鍵及功能性構(gòu)象。而m-calpain則受ERp75的調(diào)節(jié)，ERp75是一種屬于熱休克蛋白Hsp70家族的分子伴侶，有包括導(dǎo)入線粒體、新合成的細(xì)胞核和線粒體編碼蛋白質(zhì)的適當(dāng)折疊等多重功能。ERp75使線粒體m-calpain大亞基發(fā)生折疊［9］。

3 線粒體calpains在細(xì)胞凋亡中的作用機制

胞質(zhì)［Ca2+］增加引起線粒體 Ca2+超載，激活線粒體calpains，觸發(fā)細(xì)胞凋亡［10］。Na+／Ca2+交換蛋白（NCX）是線粒體Ca2+流出的主要通道。［Ca2+］m升高激活線粒體μcalpain，剪切NCX，可能在平滑肌細(xì)胞死亡過程中發(fā)揮著重要作用［11］。根據(jù)線粒體膜間隙釋放的凋亡蛋白如細(xì)胞色素C（Cyt-C）和凋亡誘導(dǎo)因子（apoptosis-inducing factor，AIF）的不同，凋亡信號通路可分為caspase依賴和非caspase依賴型途徑。經(jīng)典的線粒體凋亡通路是指Cyt-C、凋亡活化因子-1（Apaf-1）和procaspase-9組成的凋亡復(fù)合體激活caspase-9，引發(fā)下游系列caspase事件。AIF是caspase非依賴性死亡效應(yīng)因子，其從線粒體釋放后轉(zhuǎn)位至細(xì)胞核，使染色質(zhì)固縮和DNA降解。線粒體calpains在caspase依賴型和非依賴型細(xì)胞凋亡通路中均發(fā)揮著重要的作用。

3.1 Caspase依賴型細(xì)胞凋亡 calpains通過直接或間接與caspases相互作用，在細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用。上述兩種蛋白酶有許多共同的底物，如α-胞襯蛋白（αfodrin）、多聚 ADP核糖聚合酶（poly ADP ribose polymerase，PARP）和鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶IV（CaMKIV）等。甚至它們互為對方的底物，這無疑增加了其相互關(guān)系的復(fù)雜性。根據(jù)組織特異性和環(huán)境的不同，calpains在調(diào)節(jié)caspases活性過程中可能發(fā)揮促凋亡或抗凋亡作用。凋亡活化因子-1（Apaf-1）與Cyt-C結(jié)合并激活caspase-9，研究發(fā)現(xiàn)calpain能降解caspase-9，而caspase-9是caspase-3的上游信號分子，將間接導(dǎo)致caspase-3活性下降。另外活化的calpain能激活caspase-3，caspase-3又能間接增強calpain的活性［12］。這是因為calpastatin是 caspase-3和 calpain的共同底物，增強caspase-3的活性會降低細(xì)胞內(nèi)calpastatin的水平，間接促進(jìn)calpain的激活，活化的calpain進(jìn)一步激活caspase-3。在神經(jīng)細(xì)胞凋亡中，calpain能激活caspase-12，使用calpain抑制劑后可完全阻止caspase-12的激活［13-14］，在研究 β-TC3細(xì)胞凋亡時發(fā)現(xiàn)m-calpain能激活caspase-3和caspase-12［15］。

Calpains和Bcl-2蛋白家族的剪切密切相關(guān)［16］?；罨腸alpains切割Bax的N-末端（Asp33），產(chǎn)生18 ku的促凋亡片段（Bax／p18）［17］。與完整的 Bax不同，Bax／p18失去了與抗凋亡蛋白Bcl-2或Bcl-xL相互作用的能力。而且calpain的激活與Bax從胞質(zhì)移位至線粒體有關(guān)［18］。Calpains還能剪切促凋亡蛋白Bid生成tBid，后者誘導(dǎo)Bax和Bak在線粒體外膜寡聚化形成凋亡，誘導(dǎo)孔（the mitochondrial apoptosis-induced channel，MAC），經(jīng)此孔釋放 Cyt-C，與 Apaf-1結(jié)合激活caspase-9，導(dǎo)致caspase-3、7激活，完成凋亡。

3.2 非Caspase依賴型細(xì)胞凋亡 線粒體calpains在非caspase依賴型的細(xì)胞程序性死亡中也有重要作用。研究證明calpains與線粒體凋亡誘導(dǎo)因子（AIF）的剪切及釋放有關(guān)［19］。AIF是一種不依賴caspase的凋亡因子，與線粒體內(nèi)膜緊密連接，在凋亡刺激影響下，AIF經(jīng)蛋白酶水解形成57 ku的成熟AIF，釋放到胞質(zhì)中，然后轉(zhuǎn)位入核，引起染色質(zhì)凝集和DNA的降解，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。大量研究表明，calpain可能是介導(dǎo)AIF剪切及釋放過程最重要的酶。在研究視網(wǎng)膜光感受器細(xì)胞凋亡［20］和心臟缺血［21-22］時發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平持續(xù)升高，線粒體 μ-calpain激活，剪切 AIF（62 ku），生成tAIF（57 ku），使AIF從線粒體內(nèi)膜脫落釋放到膜間隙。線粒體m-calpain通過水解電壓依賴陰離子選擇性通道（voltage-dependent anion channel，VDAC），或者經(jīng)線粒體外膜上的Bax通道將tAIF釋放到胞質(zhì)。所以，AIF的釋放受線粒體μ-calpain和m-calpain的共同調(diào)節(jié)。Mizukoshi等［23］研究RCS大鼠視網(wǎng)膜變性時發(fā)現(xiàn)，線粒體calpains的激活早于胞質(zhì)calpains，因此認(rèn)為μ-calpain可能是從胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到線粒體，并與ERp57結(jié)合后再激活A(yù)IF。另外，Joshi等［24］發(fā)現(xiàn)線粒體μ-calpain與人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y中的AIF通路無關(guān)，表明線粒體μ-calpain剪切AIF有組織特異性或病理特異性。

calpain 10過度表達(dá)可誘導(dǎo)線粒體發(fā)生自噬，與MPT的形成有關(guān)［25］。Ca2+超載、氧化損傷、能量障礙等使線粒體通透性轉(zhuǎn)換（MPT）孔道開放，線粒體膜電位降低，線粒體腫脹。同樣的，calpain 10過度表達(dá)時線粒體發(fā)生腫脹、裂解，與MPT的形成一致，該變化能被MPT的抑制劑所阻斷。Calpain 10誘導(dǎo)Ca2+引起的線粒體功能紊亂可能是通過剪切電子傳遞鏈的復(fù)合物Ⅰ。越來越多的研究者認(rèn)為線粒體是細(xì)胞死亡的檢查點，壞死和凋亡的信號由此向下游傳導(dǎo)。

Fig 1 Role of mitochondrial calpains in caspase-independent apoptosis

4 線粒體calpains與神經(jīng)細(xì)胞凋亡

過去的研究表明，caspase依賴性凋亡通路在神經(jīng)細(xì)胞死亡中發(fā)揮了重要作用，其中最主要的介質(zhì)是AIF。對于AIF從線粒體的釋放有兩種假說。第1種假說與激活DNA修復(fù)酶PARP-1生成的副產(chǎn)物PAR聚合物有關(guān)。PARP-1的激活對AIF的釋放至關(guān)重要，促使生成高水平的具有神經(jīng)毒性的PAR聚合物，另外，PAR聚合物與AIF從線粒體到細(xì)胞核的轉(zhuǎn)移相關(guān)。第2種假說認(rèn)為AIF的釋放和轉(zhuǎn)移需要calpains的激活。鈣離子調(diào)節(jié)異常幾乎存在于所有神經(jīng)損傷和死亡中。相應(yīng)地，研究人員推測calpains的激活與大多數(shù)神經(jīng)退行性疾病有關(guān)，近來人們已經(jīng)從分離的大腦和肝臟線粒體，證明calpains對AIF的剪切和釋放起到重要作用。calpains激活和AIF的N端剪切被證明對AIF的轉(zhuǎn)移和缺血誘導(dǎo)的神經(jīng)元死亡很重要。研究證明PARP-1介導(dǎo)AIF釋放緊隨于calpains依賴性AIF釋放，在缺血時，PARP-1和calpains在Ca2+調(diào)節(jié)失常后共同誘導(dǎo)AIF的釋放。目前該假說的一項重要補充是PARP-1和calpains的相繼激活：PARP-1通過PAR聚合物誘導(dǎo)線粒體Ca2+失調(diào)來激活calpains。PAR聚合物可能通過誘導(dǎo)線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔（mitochondrial permeability transition pore，MPTP）的形成導(dǎo)致Ca2+超載。在分離的線粒體中，MPTP抑制劑環(huán)孢霉素能阻斷calpains介導(dǎo)Ca2+誘導(dǎo)的AIF釋放。

5 結(jié)語

眾所周知，鈣超載、氧化損傷，能量障礙是細(xì)胞凋亡的始動因素。Ca2+激活calpains，通過后者降解細(xì)胞蛋白，是鈣超載引起細(xì)胞死亡的部分機制。最近研究表明，μ-calpain、m-calpain、calpain10存在于線粒體，并受其內(nèi)源性抑制劑calpastatin的調(diào)節(jié)。據(jù)報道平滑肌和大鼠肝臟線粒體中不含calpain10，而腎臟線粒體只存在calpain10?？梢娋€粒體calpain發(fā)揮作用具有組織特異性和病理特異性。因此深入了解線粒體calpain在調(diào)節(jié)凋亡過程中的作用，不僅將有助于對細(xì)胞死亡分子機制的深入認(rèn)識，而且能為研發(fā)鈣超載消除藥、選擇性calpain亞型的特異性抑制劑，從而治療相關(guān)疾病提供新思路。

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