鄭斐群許 尹吳 彬*

（1 深圳市第三人民醫(yī)院放射科，廣東 深圳 518020；2 中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射研究所血液病實驗室，北京100850）

表達單純皰疹病毒胸苷激酶的溶瘤腺病毒靶向癌癥治療：在體外評估

鄭斐群1許 尹2吳 彬2*

（1 深圳市第三人民醫(yī)院放射科，廣東 深圳 518020；2 中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射研究所血液病實驗室，北京100850）

目的我們希望評估與單純皰疹病毒胸苷激酶相結(jié)合的溶瘤腺病毒治療效果是否更好。方法我們構(gòu)建了一種新型的溶瘤腺病毒Ad-ETK，它包含人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（hTERT）啟動子，E1A基因的編碼序列，內(nèi)部核糖體進入位點序列（IRES）和皰疹單純病毒胸苷激酶（HSV-TK）編碼序列。腺病毒Ad-ETK感染了各種腫瘤細胞，并通過用RT-PCR表明的E1A和HSV-TK基因的表達。同時測定了病毒的溶瘤能力及其與HSV-TK系統(tǒng)協(xié)同效果。并采用流式細胞儀測量病毒感染效率。結(jié)果溶瘤腺病毒Ad-ETK表達了E1A和HSV-TK基因，并且選擇性的hTERT-陽性的腫瘤細胞中復(fù)制，復(fù)制的子代病毒可達150 IU/cell。在體外研究表明，Ad-ETK加更昔洛韋（GCV）有明顯的導(dǎo)致細胞死亡的效果。結(jié)論溶瘤腺病毒加HSV-TK/GCV自殺基因顯著改善治療效果，在活體評估的結(jié)果預(yù)示的溶瘤病毒有很好的開發(fā)前景。

條件復(fù)制腺病毒；腫瘤基因治療；單純皰疹病毒胸苷激酶

條件復(fù)制腺病毒（conditionally replicating adenovirus，CRADs）是一個新興的用于癌癥的治療策略，它可以只在腫瘤細胞中復(fù)制。有兩種基本的策略，以產(chǎn)生CRADs。Ⅰ型，包括直接突變關(guān)鍵基因（如E1），充分利用無序的細胞周期調(diào)控的腫瘤細胞，如ONYX-015[1]。Ⅱ型，用人的腫瘤特異性啟動子（hTERT）替換野生型腺病毒啟動子，驅(qū)動的病毒在腫瘤細胞內(nèi)復(fù)制[2]。

端粒酶是一種核糖核蛋白復(fù)合體，具有逆轉(zhuǎn)錄酶的活性，能介導(dǎo)端粒重復(fù)序列的合成并維持其穩(wěn)定。人端粒酶由端粒酶RNA（hTR）跟組分、端粒酶相關(guān)蛋白1（TEP1、TP1）、和端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（hTERT）三部分組成。hTERT是端粒酶催化亞基，與端粒酶RNA、端粒酶相關(guān)蛋白1（hTEP1）復(fù)合物結(jié)合成全酶，激活端粒酶的活性[3]。端粒酶是人類大多數(shù)癌癥細胞永生化的主要基礎(chǔ)。端粒酶是大部分人類癌癥中過度表達，但在大多數(shù)正常組織不表達。

在癌癥治療的溶瘤腺病毒，hTERT啟動子驅(qū)動的E1A表達作為一個潛在的策略，它可以用來控制腺病毒在hTERT陽性細胞中復(fù)制。

自殺/前體藥物基因治療涉及轉(zhuǎn)讓的非哺乳動物基因編碼的酶，這種酶使腫瘤細胞本來無毒的前體藥物轉(zhuǎn)換成細胞毒素。HSV-TK/GCV是自殺/前藥系統(tǒng)中使用最廣的。TK酶可以將GCV和ACV磷酸化為一磷酸更昔洛韋，后者在細胞內(nèi)二磷酸脫氧核苷激酶作用下轉(zhuǎn)變?yōu)槎姿岷塑?，繼續(xù)磷酸化為三磷酸核苷。三磷酸核苷為細胞毒性藥物，能抑制DNA聚合酶活性，或作為DNA 鏈延伸的終止子阻止DNA 合成，導(dǎo)致細胞死亡。

在我們的研究中，我們使用了端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶控制E1A，并用IRES連接HSV-TK基因的表達，我們發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合基因治療增強了體外抗腫瘤活性。這兩種抗癌基因具有協(xié)同作用，在抗癌方面有潛在的發(fā)展希望。

1 材料與方法

1.1 腺病毒

端粒酶特異性溶瘤病毒，北京軍區(qū)總醫(yī)院譚曉華教授構(gòu)建了溶瘤腺病毒，構(gòu)建如下。Ad-ETK是利用hTERT啟動子啟動下游基因E1A、TK轉(zhuǎn)入，E1A、TK通過內(nèi)部核糖體進入位點（IRES）連接。這樣一段基因插入腺病毒中（圖1）。北京放射醫(yī)學(xué)研究所負責病毒生產(chǎn)、純化，滴定和質(zhì)量控制。

1.2 細胞系和細胞培養(yǎng)

人類肝癌細胞株SMMC-7721來源于中國上海中國科學(xué)院，生物學(xué)研究所。人類骨髓瘤細胞系SKO-007人肺腺癌GLC-82由段海鋒博士友情提供（北京放射醫(yī)學(xué)研究所，中國）。其他細胞系均從美國典型培養(yǎng)物保藏中心（ATCC，Manassa，VA）購買：轉(zhuǎn)化的人胚腎細胞株293（ATCC CRL-1573），人正常成纖維細胞細胞株BJ（ATCC編號：CRL-2522），人大腸癌細胞腺癌LS-180（ATCC。CL-187），人肝癌細胞系HEPG-2（ATCC HB-8065）和細胞系的Hep2（ATCC CCL-23）。

BJ，293，LS-180，肝癌HepG-2和Hep-2培養(yǎng)在Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基，補充有10%胎牛血清（FBS，HyClone，Logan，UT）。SMMC-7721，GLC-82，SKO-007維持在RPMI 1640加10%FBS。所有的細胞培養(yǎng)基均加了100 U/mL青霉素，100 μg/mL鏈霉素和2 mM谷氨酰胺。細胞培養(yǎng)試劑從Sigma-Aldrich公司（St Louis，MO）購買。所有細胞均保持在37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱。BJ細胞是已知的端粒酶陰性細胞，而其他細胞均為端粒酶陽性細胞。

1.3 總RNA的分離和RT-PCR

細胞感染了Ad-ETK或Ad-GFP，后者作為對照組。E1A和HSV-TK基因的表達在感染后24 h和48 h檢測。提取總RNA，使用Trizol法（Invitrogen Life Technologies公司），按照產(chǎn)品說明。RNA反轉(zhuǎn)錄（SuperScript Ⅱ reverse transcriptase; Invitrogen Life Technologies））用隨機引物。 PCR引物序列如下：E1A（sense）5'GAA GAT CTG TCA TGA GAC ATA TTA TCT GC 3'（antisense）5'GGA ATT CTT ATG GCC TGG GGC GTT T 3'。HSV-TK基因（sense）5 “CAGCAAGAAGCCACGGAAGT 3'（antisense）5'AGCACCCGCCAGTAAGTCAT 3’。β-actin （sense）5'GGG ACC TGA CTA ACT ACC TC 3'，（antisense）5'CAG TGA TCT CCT TCT GCA TC 3”。初始預(yù)變性步驟（96 ℃ 2 min）后開始PCR 30個循環(huán)（94 ℃ 30 s，58 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min）。通過1%瓊脂糖凝膠上電泳分析PCR產(chǎn)物。

1.4 細胞株的感染效率分析

用Ad-GFP感染的細胞（1×105），在串行MOI 2 h，在24孔板上。感染48 h后，收獲細胞，用PBS洗滌，并流式細胞儀分析。

1.5 在體外細胞毒性測定

腺病毒感染的細胞密度為5×103個細胞/孔接種在96孔微量滴定板。在接下來的一天，將細胞用濃度GCV（Sigma公司）在200μL的培養(yǎng)基中10～40 μmol/L。在7 d后，細胞存活率，MTT（Sigma公司）檢測定量。生存比相對于未經(jīng)處理的對照組的百分比表示。

1.6 在體外的病毒復(fù)制

指數(shù)生長期的細胞接種在6孔板中，并在每孔的密度為1×106細胞感染24 h后用Ad-ETK MOI為50。孵育2 h后，病毒除去通過兩次用PBS漂洗，然后1000 μL的新鮮培養(yǎng)基加入到各孔。收集細胞，并用培養(yǎng)物上清液24、48 h感染后結(jié)合。裂解液制備的3個周期的冷凍和解凍，并通過限制稀釋法對293 cells用于確定病毒滴度。

1.7 統(tǒng)計分析

這些數(shù)據(jù)記錄為三次以上實驗的均值±標準差（SD）。SPSS軟件用于分析數(shù)據(jù)。圖4中Hep-2和SMMC-7721細胞的生存率采用非參數(shù)檢驗。t-檢驗被用于其他數(shù)據(jù)統(tǒng)計，P＜0.05被認為有意義。

2 結(jié) 果

2.1 hTERT啟動子控制的在腫瘤細胞中的E1A和HSV-TK特異性表達

在Ad-ETK感染的細胞中，HSV-TK基因一起被轉(zhuǎn)錄與E1A基因hTERT啟動子的控制下，這是一個關(guān)鍵的基因的腺病毒的復(fù)制。它的翻譯由IRES序列驅(qū)動（IRES在轉(zhuǎn)錄單元）。E1A和HSV-TK基因表達通過RT-PCR檢測。如圖2中所示。在端粒酶陽性的腫瘤細胞株中，E1A和HSV-TK基因得到表達，端粒酶陰性的BJ細胞中則沒有的E1A和HSV-TK基因的轉(zhuǎn)錄。

2.2 腺病毒對各種細胞系的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率

為了進一步評價Ad-ETK對各種細胞株轉(zhuǎn)導(dǎo)功能，首先由GFP報道基因的腺病毒載體的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)效率分析。肝癌HepG-2細胞是高度敏感的Ad5的感染，而BJ不是。其余的測試細胞株在不同MOI的Ad-GFP感染時，GFP的表達是相互比較（表1）。

2.3 復(fù)制的Ad-ETK

在MOI為5，用Ad-ETK各種細胞系，感染和感染后產(chǎn)生的子代病毒24、48 h收獲和滴定。如圖中所示。在圖3中，病毒滴度的增加與培養(yǎng)時間有關(guān)。在腫瘤細胞中，在24 h感染后，每個細胞的滴度超過100 IU。在48 h感染后，會出現(xiàn)明顯的細胞病變效應(yīng)。于正常細胞株BJ，病毒滴度也會增加；在感染48 h后，每個細胞滴度為0.7 IU，這是遠遠低于腫瘤細胞的。這可能是因為缺乏hTERT啟動子的活性，病毒在BJ細胞中不能復(fù)制和傳播。細胞病變效應(yīng)未能在BJ細胞中觀察到。這些數(shù)據(jù)表明，Ad-ETK可在端粒酶陽性的腫瘤細胞中特異性地復(fù)制和傳播。

2.4 GCV增強Ad-ETK抗腫瘤活性

如圖4所示；Ad-ETK在各種端粒酶陰性細胞系如BJ細胞，即使在高MOI為80的情況下，并沒有多少殺傷效應(yīng)。但在100 MOIAd-ETK加40μMGCV治療可能引起的近30%的BJ細胞死亡。在第7天感染后，100 MOI的Ad-ETK造成約50%的細胞死亡。Ad-ETK加GCV治療均高于Ad-ETK或GCV單獨治療效果。在所有hTERT的陽性細胞中，都能觀察到溶瘤病毒和HSV-TK/GCV系統(tǒng)的這種協(xié)同作用，在SKO-007細胞中尤為顯著。這可能是因為不同的細胞系對GCV代謝有不同的敏感性。

圖1 構(gòu)建的Ad-ETKAd-ETK包含順序定位hTERT啟動子調(diào)控的E1A基因，IRES和HSV-TK基因的編碼序列的編碼序列。 ITR，反向末端重復(fù)

圖2 hTERT啟動子調(diào)控的腫瘤特異性表達E1A和HSV-TK。細胞分別被AD-GFP與Ad-ETK感染24、48 h。從受感染的細胞中提取總RNA進行RTPCR檢測。 β-肌動蛋白作為內(nèi)參

圖3 幾種人類細胞系中的Ad-ETK繁殖感染細胞用Ad-ETK MOI為5，然后一起收集的培養(yǎng)基中產(chǎn)生的子代病毒，測定感染后在指定的時間點（24、48 h）的滴度。圖表顯示的是復(fù)制的平均值

Abbreviation: GFP，green fl uorescent protein; MOI，multiplicity of infection.

縮寫詞：綠色熒光蛋白，綠色熒光蛋白; MOI，多重感染。感染不同MOI的Ad-GFP的細胞系，MOI分別為50、100和200。感染后48 h后，收集細胞，并用2%多聚甲醛固定，然后用流式細胞儀分析。結(jié)果為表達GFP陽性細胞的百分比

表1 不同細胞系感染不同MOI情況下，GFP的表達

圖4 溶瘤腺病毒和HSV-TK/GCV自殺基因系統(tǒng)的協(xié)同作用在一系列感染復(fù)數(shù)（MOI）的Ad-ETK或Ad-GFP感染培養(yǎng)的細胞在96孔板，7 d感染后MTT法測定細胞的存活率。在每一個MOI中，與GCV組比較，*P＜0.005

3 討 論

對于癌癥，常規(guī)治療經(jīng)常是無效的。人們盼望新的治療方法。腺病毒由于其生物學(xué)特性，是有希望構(gòu)建為溶瘤病毒的載體。腺病毒的復(fù)制，導(dǎo)致宿主細胞破壞，在一個單一的復(fù)制周期中，病毒載量能達到1000倍的放大，使病毒廣泛傳播。使得腺病毒用于癌癥治療的有吸引力的另一個特點是，高滴度的病毒種群（1010PFU/ mL）可以生產(chǎn)，它同時可以被濃縮100倍。重組和突變的風(fēng)險概率低，因為病毒的基因組不整合到細胞基因組中[10]。由于能在腫瘤細胞中的特定的復(fù)制和蔓延，CRADs是有希望的癌癥基因治療的新的工具。一種啟動子活躍在各種各樣的腫瘤中，但在正常組織中不活躍；這種特性允許CRAD在腫瘤細胞中復(fù)制并殺死腫瘤細胞。hTERT啟動子是活躍在大部分腫瘤細胞，它是一個有吸引力的候選基因，適用于各種腫瘤的治療的構(gòu)建。選擇性復(fù)制的CRADs可以通過以下修改來實現(xiàn)：修飾重要的調(diào)節(jié)基因，該基因是病毒繁殖的關(guān)鍵。復(fù)制調(diào)節(jié)基因大多表達在病毒的循環(huán)周期的早期階段，位于E1，E2，E3和E4區(qū)域。E3基因表達幫助病毒逃避宿主的免疫系統(tǒng)，對于病毒復(fù)制并不是必要的[11]。E1和E4基因的表達產(chǎn)物為腺病毒靶向特定細胞和組織中復(fù)制[12]。 Bischoff等[13]證實刪除了編碼E1b Mr 55 kD整段基因的H5dl1520，也稱為ONYX-015；它能在腫瘤細胞中復(fù)制，優(yōu)先溶解p53的功能失調(diào)的腫瘤細胞。不表達治療基因的這種病毒，已被用于臨床試驗中，結(jié)合順鉑應(yīng)用在頭部和頸部晚期腫瘤患者中。因此，在這項研究中，我們也創(chuàng)建了一個E1b Mr 55 kD刪除的CRAD。

許多溶瘤腺病毒有小基因的克隆能力。在這里，我們利用前藥激活基因系統(tǒng)涵括前藥GCV和HSV-TK基因。將基因?qū)肽[瘤細胞后，使得無毒性的前體藥物GCV或ACV轉(zhuǎn)化為單磷酸核苷，并進一步轉(zhuǎn)化為三磷酸核苷，后者是細胞毒性藥物，能夠抑制聚合酶的作用，并摻入到DNA鏈的末端，從而抑制的DNA合成，引起細胞死亡。GCV的毒性代謝產(chǎn)物抑制細胞DNA的合成，并可以通過縫隙連接擴散到未轉(zhuǎn)染病毒瘤細胞，提高受感染的細胞旁的毒性作用（旁觀者效應(yīng)）。把這個系統(tǒng)的溶瘤腺病毒的抗腫瘤效果有爭議性，一些研究顯示與單獨病毒相比，增加抗腫瘤作用[14-16]，另外一些文獻則不同意[17-19]。這些爭議的結(jié)果可能是因為不同細胞對的GCV代謝產(chǎn)物的毒性敏感性差異。另外一個影響因素可能是縫隙連接的數(shù)量各不相同，導(dǎo)致較弱的旁觀者效應(yīng)[21，21]。

在這項研究中，hTERT啟動子被用來啟動腺病毒E1A和HSV-TK基因的表達，使所得CRAD特異性地在端粒酶陽性的腫瘤細胞內(nèi)復(fù)制，并與GCV有協(xié)同效應(yīng)。通過RT-PCR證明E1A和HSV-TK治療基因表達在感染Ad-ETK的hTERT陽性細胞中。Ad-ETK可以有選擇地復(fù)制，然后溶解端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶陽性細胞。GCV治療可顯著提高溶瘤腺病毒治療。

數(shù)據(jù)表明：在體外，HSV-TK/GCV自殺基因系統(tǒng)和溶瘤腺病毒有協(xié)同作用。在將來，端粒酶依賴的溶瘤腺病毒加HSV-TK/GCV自殺基因療法可能被作為廣譜抗腫瘤治療藥物而被開發(fā)的。

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An Oncolytic Adenovirus Expressing Herpes Simplex Virus-thymidine Kinase for Targeting Cancer Therapy: An in vitro Evaluation

ZHENG Fei-qun1, XU Yin2, WU bin2
(1 Department of Radiology, Shenzhen Third People’s Hospital, Shenzhen 518020, China; 2 Department of Experimental Hematology, Radiation People's Liberation Army Academy of Military Medical Sciences, Beijing 100850, China)

ObjectiveWe wish to evaluate whether a strategy that combines the herpes simplex virus—thym idine kinase with oncolytic effects offers a therapeutic advantage.MethodsA novel adenovirus Ad-ETK containing a sequentially positioned promoter of human telomerase reverse transcriptase(hTERT), the coding sequence of E1A gene, an internal ribosome entry site sequence(IRES)and the coding sequence of herpes simplex virus. thymidine kinase(HSV-TK)was constructed.Infection of various cells with Ad-ETK followed by RT-PCR confirmed the expression of EIA and HSV-TK.The oncolytic ability and synergism between oncolytic effects and HSV-TK system was measured.The infection eficiency was determined by flow cytometry.ResultsAd-ETK deliverys E1A and HSV-TK gene, which selectively replicates in hTERT-positive tumor cells, and the progeny virus can reach up to 150 IU/cel1.Our in vitro study showed that Ad-ETK plus ganciclovir(GCV) induced an obvious cell death.ConclusionAn oncolytic adenovirus plus the HSVTK/GCV suicide gene system resulted in a significant improvement in treatment efficacy and it may offer important considerations in the development and preclinical assessments of oncolytic virotherapy.

Conditionally replicative adenovirus; Cancer gene therapy; Herpes simplex virus-thymidine kinase

R752.11

B

1671-8194（2014）22-0084-04

*通訊作者：E-mail： wubin63@yahoo.com.cn