李小艷，劉書亮，黃道梅，蒲 彪

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，四川雅安 625014)

乳酸菌作為一類可發(fā)酵糖產(chǎn)酸，對(duì)營養(yǎng)要求苛刻的中溫型細(xì)菌，一般在低于15℃的條件下很難生長［1－2］。目前為止較多研究的是常溫下分離的乳酸菌，所以泡菜工業(yè)化生產(chǎn)使用的菌劑也多為中溫型乳酸菌制備的［3－5］，然而四川泡菜生產(chǎn)上蔬菜的收獲和鹽漬發(fā)酵也多集中在冬季，氣溫偏低，常溫乳酸菌對(duì)泡菜的發(fā)酵速度過慢或停止，因而酸度低，雜菌抑制能力弱，為保證腌漬蔬菜不變質(zhì)，必須增加食鹽用量，導(dǎo)致在成品泡菜生產(chǎn)中增加脫鹽工藝和廢水處理成本，甚至還需要添加有機(jī)酸以符合泡菜酸度的要求，不但影響了泡菜品質(zhì)還制約著泡菜的工業(yè)化生產(chǎn)，耐低溫乳酸菌的應(yīng)用可以解決這一生產(chǎn)問題。

乳酸菌培養(yǎng)過程中會(huì)受到許多因素的影響，其中乳酸菌的加富培養(yǎng)需要良好的增殖培養(yǎng)基［2，6］。實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)乳酸菌常用的MRS培養(yǎng)基不僅成分復(fù)雜、成本高、制作繁瑣，而且接種乳酸菌培養(yǎng)后的發(fā)酵液黏度以及蛋白沉淀又不利于菌體的分離收集，而泡菜乳酸菌的培養(yǎng)可采用廉價(jià)易得的白菜汁、胡蘿卜汁等。由于不同乳酸菌生長條件存在一定差異，因此篩選出不同種類乳酸菌的最適增殖培養(yǎng)基具有重要意義［7－8］。迄今為止，對(duì)于低溫乳酸菌的研究報(bào)道較少，楊曉輝等［7］研究了30℃條件下，分離自泡菜的4株低溫發(fā)酵乳酸菌Lat.1、Lat.2、Leu.1和leu.2在不同蔬菜汁培養(yǎng)基中的增殖情況;田菊梅等［8］研究了2株低溫乳酸菌CGMCC4775和CGMCC4776在20～30℃條件下，混菌培養(yǎng)的增殖情況，然而對(duì)于低溫(10℃)條件下，低溫乳酸菌加富培養(yǎng)的研究尚未見報(bào)道。

本文以兩株源于四川泡菜的優(yōu)良耐低溫泡菜乳酸菌 3m－1(Lactobacillus plantarum)和 8m－9(Leuconostoc mesenteroides)為對(duì)象，10℃條件下，通過在白菜汁培養(yǎng)基中添加碳源、氮源及緩沖劑優(yōu)化了其最適的增殖培養(yǎng)基配方。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

植物乳桿菌3m－1(Lactobacillus plantarum)，腸膜明串珠菌8m－9(Leuconostoc mesenteroides)分離于四川泡菜樣品，現(xiàn)由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品微生物實(shí)驗(yàn)室保藏。

培養(yǎng)基:MRS培養(yǎng)基;白菜汁基礎(chǔ)培養(yǎng)基按文獻(xiàn)［9］制備。

主要藥品:蛋白胨、胰蛋白胨、大豆蛋白胨、酵母膏、牛肉膏、瓊脂粉等 均為生化試劑(BR);檸檬酸二胺、葡萄糖、乳糖、硫酸鎂、硫酸錳、乙酸鈉、磷酸氫二銨、吐溫80、碳酸鈣等 均為分析純(AR)。

主要儀器:DHP－9162型電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海一恒科技有限公司;手提式壓力蒸汽滅菌鍋 上海華線醫(yī)用核子儀器有限公司;pH計(jì) PB－10;DHG－9245A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海一恒科技有限公司;SW－CJ－1F潔凈工作臺(tái) 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 10℃條件下兩株低溫乳酸菌生長曲線的測定將活化菌株接種于白菜汁基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，10℃培養(yǎng)192h，每12h取樣，測定發(fā)酵液活菌數(shù)、OD600/10和pH，確定培養(yǎng)菌株的收獲期。

1.2.2 兩株低溫乳酸菌增殖因子的篩選 在白菜汁基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，分別添加1%蛋白胨、1%大豆蛋白胨、1%胰蛋白胨、1%牛肉膏、0.5%酵母膏、1%乳糖、2%葡萄糖、0.2%磷酸氫二鉀、0.5%CaCO3，制成各種不同增殖培養(yǎng)基，將活化菌株接種于上述培養(yǎng)基中，10℃培養(yǎng)72h，測定發(fā)酵液培養(yǎng)前后活菌數(shù)和pH。

1.2.3 兩株低溫乳酸菌增殖的最適培養(yǎng)基配方的優(yōu)化 向白菜汁基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加對(duì)菌株生長影響較大的營養(yǎng)因子，按正交實(shí)驗(yàn)因素水平表1(考慮單因素水平對(duì)菌株生長影響同時(shí)參考文獻(xiàn)［9］)配制培養(yǎng)基。將活化菌株接種于上述培養(yǎng)基中，10℃培養(yǎng)72h，測定發(fā)酵液培養(yǎng)前后活菌數(shù)和pH。

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素水平表Table 1 The factor level of orthogonal experiment

1.2.4 兩株低溫乳酸菌增殖的最適培養(yǎng)基配方的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 將活化菌株接種于白菜汁基礎(chǔ)培養(yǎng)基、MRS培養(yǎng)基以及優(yōu)化的最適培養(yǎng)基中，10℃培養(yǎng)72h，測定發(fā)酵液培養(yǎng)前后活菌數(shù)和pH。

1.2.5 幾個(gè)指標(biāo)的測定方法 活菌數(shù):采用平板菌落計(jì)數(shù)法;

OD600/10:采用無菌生理鹽水將培養(yǎng)液稀釋10倍，在600nm下測定其吸光度值;

pH:采用精密pH計(jì)直接測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 10℃條件下兩株耐低溫乳酸菌的生長曲線

10℃條件下，菌株3m－1和8m－9在白菜汁基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的生長曲線分別如圖1和圖2所示。由圖1和圖2可知，10℃條件下，菌株3m－1和8m－9在白菜汁基礎(chǔ)培養(yǎng)基中培養(yǎng)12h后細(xì)胞生物量開始快速增加，同時(shí)發(fā)酵液pH顯著降低，72h后細(xì)胞生物量和發(fā)酵液pH都趨于穩(wěn)定，活菌數(shù)達(dá)到最大值，分別為1.12×109cfu/mL和 8.5×108cfu/mL，菌株3m－1在培養(yǎng)132h后活菌數(shù)開始下降，而菌株8m－9在培養(yǎng)84h后活菌數(shù)開始下降，從整個(gè)發(fā)酵過程可確定菌株的最佳收獲期為72h。

圖1 10℃條件下菌株3m－1在白菜汁基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的生長曲線Fig.1 The growth curve of strain 3m－1 in cabbage basal medium at 10℃

圖2 10℃條件下菌株8m－9在白菜汁基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的生長曲線Fig.2 The growth curve of strain 8m－9 in cabbage basal medium at 10℃

2.2 兩株低溫乳酸菌增殖因子的篩選結(jié)果

10℃條件下，白菜汁基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加不同營養(yǎng)因子，菌株3m－1和8m－9的生長情況見表2。乳酸菌為化能異養(yǎng)菌，營養(yǎng)要求苛刻［10］，MRS培養(yǎng)基雖可滿足乳酸菌的營養(yǎng)需求，但其成分復(fù)雜，成本較高，發(fā)酵液的黏度及蛋白沉淀又會(huì)影響菌體的分離收集，所以也有采用廉價(jià)易得的蔬菜汁培養(yǎng)基［11－12］。本實(shí)驗(yàn)以白菜汁為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，通過添加不同的增殖因子，以期獲得高活菌數(shù)，而且白菜汁的馴化環(huán)境可以使菌種更好的適應(yīng)泡菜發(fā)酵;乳酸菌發(fā)酵過程中會(huì)產(chǎn)生乳酸降低發(fā)酵液pH而抑制其生長，所以可通過添加磷酸緩沖液或鈣鹽消除抑制［15］。由表2可知，10℃條件下，添加的不同增殖因子對(duì)菌株3m－1和8m－9均有不同的增殖效果(p＜0.05)，但活菌數(shù)都低于MRS培養(yǎng)基(p＜0.05)，其中以蛋白胨、牛肉膏、乳糖和葡萄糖為最佳增殖因子，為乳酸菌提供豐富的氮源和碳源;添加的緩沖劑—磷酸氫二鉀和碳酸鈣都具有一定的增殖效果(p＜0.05)，但碳酸鈣會(huì)沉積底部，不利于收集菌體，因此選用磷酸二氫鉀作為緩沖劑。

表2 在白菜汁基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加不同營養(yǎng)因子對(duì)菌株3m－1和8m－9生長的影響Table 2 Effects of adding different nutritional factors into cabbage basal medium on the growth of strain 3m－1 and 8m－9

表3 優(yōu)化菌株3m－1增殖培養(yǎng)基的四因素三水平(L34)正交實(shí)驗(yàn)表Table 3 Design of enrichment media optimization orthogonal experiment of strain 3m－1

2.3 兩株低溫乳酸菌增殖培養(yǎng)基的最適培養(yǎng)基配方

10℃條件下，兩株耐低溫乳酸菌(菌株3m－1和8m－9)在白菜汁基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加不同增殖因子正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果分別見表3和表4。不同乳酸菌的生長條件存在一定的差異。由表3可知，增殖因子對(duì)菌株3m－1生長的影響順序?yàn)?蛋白胨＞葡萄糖＞牛肉膏＞乳糖，其增殖的改良白菜汁培養(yǎng)基配方為:白菜汁基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加1.0%蛋白胨、0.5%牛肉膏、1.0%乳糖、1.5%葡萄糖、0.2%磷酸氫二鉀，10℃條件下培養(yǎng)72h，活菌數(shù)達(dá)到6.05×109cfu/mL，明顯高于其它培養(yǎng)基(p＜0.05);由表4可知，增殖因子對(duì)菌株8m－9生長的影響順序?yàn)?蛋白胨＞牛肉膏＞葡萄糖＞乳糖，其增殖的改良白菜汁培養(yǎng)基為:白菜汁基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加1.5%蛋白胨、1.0%牛肉膏、0.5%乳糖、1.5%葡萄糖、0.2%磷酸氫二鉀，10℃條件下培養(yǎng)72h，活菌數(shù)達(dá)到7.45×109cfu/mL，明顯高于其它培養(yǎng)基(p＜0.05)。乳酸菌對(duì)蛋白分解能力較弱，培養(yǎng)基中氨基酸的含量直接影響其增殖的速度，其中水解的蛋白類物質(zhì)如蛋白胨和牛肉膏可以為其提供豐富的氮源，同時(shí)乳酸菌利用糖產(chǎn)酸，其中葡萄糖和乳糖為其提供豐富的碳源促進(jìn)其生長。

表4 優(yōu)化菌株8m－9增殖培養(yǎng)基的四因素三水平(L34)正交實(shí)驗(yàn)表Table 4 Design of enrichment media optimization orthogonal experiment of strain 8m－9

表5 不同培養(yǎng)基對(duì)菌株3m－1和8m－9生長的影響Table 5 Effects of growth in strain 3m－1 and 8m－9 after incubation at different media

2.1.4 最優(yōu)培養(yǎng)基驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果 10℃條件下，不同培養(yǎng)基對(duì)菌株3m－1和8m－9生長的影響結(jié)果見表5。由表5可知，菌株3m－1和8m－9在改良白菜汁培養(yǎng)基中培養(yǎng)72h后活菌數(shù)分別達(dá)到6.05×109cfu/mL和7.35×109cfu/mL，與白菜汁基礎(chǔ)培養(yǎng)基相比，提高了6.1倍和10.4倍且差異性顯著(p＜0.05)，而與采用MRS培養(yǎng)基培養(yǎng)的活菌數(shù)相近無顯著性差異(p＞0.05)。

3 討論與結(jié)論

泡菜作為我國傳統(tǒng)的乳酸菌發(fā)酵食品，其中蘊(yùn)含豐富的乳酸菌資源［1］，而乳酸菌作為一類化能異養(yǎng)菌，蛋白質(zhì)分解和氨基酸合成能力較弱，只能通過糖類發(fā)酵獲取能量，對(duì)培養(yǎng)基的營養(yǎng)要求比較苛刻，所以需向其生長的環(huán)境提供適量的營養(yǎng)物質(zhì)［10，13－14］。

迄今為止，關(guān)于乳酸菌增殖培養(yǎng)基的報(bào)道也多為常溫條件下的研究［15－16］，本文以兩株源于四川泡菜的耐低溫乳酸菌3m－1(Lactobacillus plantarum)和8m－9(Leuconostoc mesenteroides)為對(duì)象，選用廉價(jià)的富含碳水化合物、維生素、無機(jī)鹽及植物蛋白，能滿足乳酸菌的基本生長的白菜汁為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，同時(shí)為提高其增殖效果，向白菜汁培養(yǎng)基中添加了增殖因子碳源、氮源及緩沖劑，最終確定了其增殖培養(yǎng)基分別為:白菜汁基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加蛋白胨1.0%，牛肉膏0.5%，乳糖1.0%，葡萄糖1.5%，磷酸氫二鉀0.2%;白菜汁基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加蛋白胨1.5%，牛肉膏1.0%，乳糖 0.5%，葡萄糖 1.5%，磷酸氫二鉀0.2%，優(yōu)于吳蕊［9］等在低溫條件分離了腸膜明串珠菌LN、植物乳桿菌JL和短乳桿菌LS，而在30℃條件下優(yōu)化了短乳桿菌LS的白菜汁增殖培養(yǎng)基，且同時(shí)確定了腸膜明串珠菌LN和植物乳桿菌JL的增殖培養(yǎng)基，而且 10℃條件下，耐低溫乳酸菌 3m－1(Lactobacillusplantarum)和8m－9(Leuconostoc mesenteroides)在上述培養(yǎng)基中培養(yǎng)72h，活菌數(shù)分別可達(dá)6.05×109cfu/mL和7.35×109cfu/mL，較白菜汁基礎(chǔ)培養(yǎng)基分別提高了6.1倍和10.4倍，但與采用MRS培養(yǎng)基的活菌數(shù)相近，區(qū)別于劉丹［17］等研究了37℃條件下，以MRS培養(yǎng)基為對(duì)象，通過玉米漿代替蛋白胨的同時(shí)添加番茄汁優(yōu)化了嗜酸乳桿菌的增殖培養(yǎng)基，其不僅滿足了乳酸菌的生長獲得了高活菌數(shù)，而且節(jié)約成本的同時(shí)簡化了培養(yǎng)基成分，從而縮減了代謝產(chǎn)物的積累使得菌體更易分離，同時(shí)選用白菜汁培養(yǎng)基能夠使泡菜乳酸菌菌株快速適應(yīng)發(fā)酵的環(huán)境。研究結(jié)果對(duì)制備低溫乳酸菌發(fā)酵劑具有指導(dǎo)意義，同時(shí)也為低溫發(fā)酵泡菜的生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。

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