李丹丹 吳茂玉 宋 燁 朱風(fēng)濤 馬曉燕

（1.齊魯工業(yè)大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，山東濟(jì)南250353；

2.中華全國(guó)供銷合作總社濟(jì)南果品研究院，山東濟(jì)南250014）

枸杞（Lycium barbarumL.）是茄科枸杞屬的多分枝灌木植物，主要產(chǎn)于我國(guó)新疆、青海、寧夏等地，國(guó)外主要分布在日本、朝鮮、歐洲及北美等地。枸杞含有豐富的多糖、脂肪、蛋白質(zhì)、游離氨基酸及維生素等，特別是類胡蘿卜素含量很高[1]。研究表明，枸杞具有滋肝養(yǎng)腎、明目的功效[2]。在枸杞眾多功效成分中，對(duì)枸杞多糖（Lycium Barbarum Polysaccharides,LBP）的研究最為熱門，近代研究發(fā)現(xiàn)，枸杞多糖具有增強(qiáng)機(jī)體免疫力、抗腫瘤、防衰老、增加造血功能等活性功能[3]。因此提取枸杞多糖對(duì)開發(fā)和利用枸杞資源有重要的意義。

本文就提取中影響枸杞多糖得率的幾個(gè)重要因素做了系統(tǒng)研究，并運(yùn)用響應(yīng)面分析（Response Surfaceanalysis,RSA）法[4]對(duì)枸杞多糖的提取條件進(jìn)行了優(yōu)化。用Box-Behnken的中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，對(duì)擬合數(shù)學(xué)模型進(jìn)行了較為詳細(xì)的描述，得到了枸杞多糖提取的最佳條件。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料

干制枸杞，購(gòu)買于新疆中寧縣。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

葡萄糖，硫酸，苯酚，酒石酸鉀鈉，無水亞硫酸鈉，氫氧化鈉，3,5-二硝基水楊酸等，以上試劑均為分析純。

1.2 儀器和設(shè)備

數(shù)顯式電熱恒溫水浴鍋，購(gòu)于上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；萬能粉碎機(jī)，購(gòu)于天津市泰斯特儀器有限公司；TU180紫外可見分光光度計(jì)，購(gòu)于北京普析通用儀器有限公司；

SHB-Ⅲ循環(huán)水式真空泵，購(gòu)于鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司；

R-3旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，購(gòu)于瑞士。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 熱水浸提枸杞多糖的工藝流程

圖1 熱水浸提LBP的工藝流程Fig.1 The process of hotwater extract LBP

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

總糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：采用苯酚硫酸法[5]。用分析天平精確稱取10mg干燥恒重的無水葡萄糖，溶解定容100mL配制成濃度為100μg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液備用。分別移取 0.0mL、0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL、1.2mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液置于編號(hào)為 0、1、2、3、4、5、6的試管中，其中0號(hào)管為空白對(duì)照。向各試管加入蒸餾水達(dá)到液體總量為2.0mL，分別加入1.0mL 6%苯酚，搖勻后立即加入5.0mL濃硫酸，室溫放置15min后沸水浴30min，冷卻后在490nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光值，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

還原糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：采用3,5-二硝基水楊酸法（DNS法）[6]。

DNS溶液的配制：稱取酒石酸鉀鈉182g，用500mL蒸餾水溶解，水浴加熱（不超過50℃），在熱溶液的環(huán)境下加入6.3g 3,5-二硝基水楊酸、2.1g NaOH、5.0g重結(jié)晶酚、5.0g無水Na2SO3，不停地?cái)嚢柚脸浞秩芙?，冷卻后用蒸餾水定容于1L容量瓶中，備用。

還原糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：用分析天平精確稱取100mg干燥且恒重的無水萄糖，蒸餾水定容于100mL容量瓶中，配成濃度為1mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)液。精密移取 0.0mL、0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL、1.2mL標(biāo)準(zhǔn)液分別置于編號(hào)為 0、1、2、3、4、5、6的25mL容量瓶中，其中0號(hào)為空白對(duì)照，用蒸餾水補(bǔ)至2.0mL。然后分別加入DNS試劑1.5mL，搖勻，放入沸水浴中加熱5min，立刻用流水冷卻，定容，搖勻，2min后于540nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光值，繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.3 枸杞多糖得率的計(jì)算

取一定體積的多糖浸提液并用蒸餾水稀釋到標(biāo)準(zhǔn)曲線的濃度范圍內(nèi)，按照1.3.2的方法進(jìn)行顯色，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線分別計(jì)算總糖、還原糖的量和多糖含量。

式中：枸杞干粉的質(zhì)量，g。

1.3.4 枸杞多糖最佳提取工藝條件的確定

通過單因素試驗(yàn)結(jié)果分析，選擇料液比、浸提溫度、浸提時(shí)間為試驗(yàn)因素，以多糖得率為衡量指標(biāo)，對(duì)影響多糖得率的因素進(jìn)行了Box-Behnken試驗(yàn)，運(yùn)用Design Expert6.0軟件進(jìn)行響應(yīng)面分析，優(yōu)化得到最佳提取工藝條件。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取枸杞多糖的單因素試驗(yàn)

2.1.1 料液比對(duì)枸杞多糖得率的影響

圖2 料液比對(duì)枸杞多糖得率的影響Fig.2 Effects of solid-liquid ratio on the yield of LBP

稱取一定質(zhì)量的枸杞粉，分別設(shè)計(jì)料液比為1:10、1:15、1:20、1:25、1:30，單位為 g/mL，在某個(gè)溫度下提取一定的時(shí)間，不同料液比下的枸杞多糖得率如圖2所示。

由圖2可以看出，在其他條件一定的情況下，隨著料液比的減小，枸杞多糖的得率逐漸增大并且呈明顯的上升趨勢(shì)。當(dāng)料液比增加到1:30時(shí)，枸杞多糖的得率達(dá)到最大值，但此時(shí)的得率與1:25條件下的得率相差很小，基本上呈持平狀態(tài)，可知，當(dāng)料液比超過1:25時(shí)，料液比的減小對(duì)枸杞多糖得率的影響不明顯，因此從經(jīng)濟(jì)的角度考慮，料液比選擇1:25較為適宜。

2.1.2 浸提溫度對(duì)枸杞多糖得率的影響

稱取一定質(zhì)量的枸杞粉末，按料液比為1:25添加蒸餾水，分別于 50、60、70、80、90、100℃下浸提一定的時(shí)間，不同反應(yīng)溫度下的枸杞多糖的得率如圖3所示。

圖3 浸提溫度對(duì)枸杞多糖得率的影響Fig.3 Effects of extraction tem perature on the yield of LBP

由圖3可知，溫度對(duì)枸杞多糖的得率影響較大，隨著溫度的不斷上升，枸杞多糖的得率也在不斷增加。反應(yīng)溫度為100℃時(shí)多糖得率達(dá)到實(shí)驗(yàn)最大值，但相比于90℃時(shí)的得率而言增長(zhǎng)空間較小，這可能是高溫導(dǎo)致了多糖的降解，從而降低了多糖的浸出率[7]。因此，多糖浸出的適宜溫度為90℃。

2.1.3 浸提時(shí)間對(duì)枸杞多糖得率的影響

稱取一定質(zhì)量的枸杞粉末，按料液比為1:25添加蒸餾水，分別于90℃下水浴加熱浸提0.5、1、1.5、2、2.5、3h，多糖得率隨著反應(yīng)時(shí)間的變化曲線如圖4所示。由圖可知，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，多糖的得率呈現(xiàn)急劇增加的趨勢(shì)，當(dāng)時(shí)間達(dá)到2.5h時(shí)曲線逐漸趨于平衡。可見加熱浸提2.5h以后，多糖的得率變化不明顯，這可能是由于長(zhǎng)時(shí)間的加熱引起了多糖的降解，從而使得多糖得率下降[8]。所以綜合考慮，選擇熱水浸提時(shí)間為2.5h。

圖4 浸提時(shí)間對(duì)枸杞多糖得率的影響Fig.4 Effects of extraction time on the yield of LBP

2.2 采用響應(yīng)面分析法對(duì)枸杞多糖提取工藝的優(yōu)化

2.2.1 響應(yīng)面分析因素水平的選取

表1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平取值Tab.1 Code and level of variables chosen for the trials

表2 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及響應(yīng)值Tab.2 Box-Behnken experimental design arrangement and responses

表3 回歸模型方差分析Tab.3 Analysis of variance(ANOVA)for regression equation for liquefaction process

根據(jù)的Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，結(jié)合單因素試驗(yàn)的結(jié)果，選取料液比（X1）、浸提溫度（X2）、浸提時(shí)間（X3）為考察因素，用 -1、0、1來表示低、中、高三水平，進(jìn)行三因素三水平響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平取值見表1。

2.2.2 響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果

以上述因素為自變量，以多糖得率（Y）為響應(yīng)值，進(jìn)行響應(yīng)面分析試驗(yàn)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及試驗(yàn)結(jié)果見表2。

利用Design Expert6.0軟件對(duì)表2中的結(jié)果進(jìn)行回歸分析，對(duì)各因素回歸擬合后，得到多糖得率對(duì)料液比（X1）、浸提溫度（X2）、浸提時(shí)間（X3）的 3元 2次回歸方程為：

對(duì)回歸方程進(jìn)行方差分析和顯著性檢驗(yàn)結(jié)果如表3所示。從表3可知，回歸項(xiàng)F值=97.21，P＜0.0001，說明所選擇模型極顯著。表中的X1、X2、X3、X12、X22、X32、X1X3的 Pr＞F值均小于 0.0001，說明這些均是極顯著的模型項(xiàng)。失擬項(xiàng)F值為1.93，說明失擬項(xiàng)和純誤差的差異不顯著，表明該二次回歸模型能夠較顯著擬合料液比、浸提溫度、浸提時(shí)間對(duì)枸杞多糖得率的影響?；貧w模型的決定系數(shù)R2=0.9921，說明響應(yīng)值的變化有99.21%來自于所選變量，因此回歸方程可以很好地描述各因素與響應(yīng)值之間的關(guān)真實(shí)關(guān)系，可以利用該回歸方程確定最佳提取條件。

2.2.3 各因素間的交互作用

根據(jù)以上回歸方程，利用Design Expert6.0軟件做不同因素間的響應(yīng)面分析圖和等高線圖，如圖5、圖6、圖7所示。該圖組可直觀地反映各因素及其交互作用對(duì)多糖得率的影響結(jié)果。其中等高線的形狀可以反映兩因素間交互作用的強(qiáng)弱，橢圓形表示兩因素間交互作用較強(qiáng)，圓形則相反[9,10]。

圖5 料液比與浸提溫度對(duì)枸杞多糖得率影響的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.5 Response surface plot and contour plot of the effects of solid-liquid ratio and extracting tem perature on the yield of LBP

從圖5～7可以直觀地看出各因素的交互作用對(duì)響應(yīng)值的影響，確定最佳因素水平范圍。根據(jù)Box-Behnken的中心組合試驗(yàn)，對(duì)回歸方程求一階偏導(dǎo)方程等于零[11]，整理得響應(yīng)值最大時(shí)，X1=0.372，X2=0.12，X3=-0.02，對(duì)三種影響因素分別作如下變換：X1=(z-25)/5、X2=(T-80)/10、X3=(t-2.5)/0.5，所以對(duì)應(yīng)的提取枸杞多糖的工藝條件為：料液比1:26.86，浸提溫度81.2℃，浸提時(shí)間為2.51h。但考慮到實(shí)際操作的便利性，將提取枸杞多糖的最佳工藝條件修正為料液比1:27，浸提溫度81℃，浸提時(shí)間為2.5h。并驗(yàn)證此條件下的枸杞多糖得率為5.03%，與模型預(yù)測(cè)值比較接近，說明用響應(yīng)面法優(yōu)化提取枸杞多糖的工藝參數(shù)可靠。

圖6 料液比與浸提時(shí)間對(duì)枸杞多糖得率影響的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.6 Response surface plot and contour plot of the effects of solid-liquid ratio and extracting time on the yield of LBP

圖7 浸提溫度與浸提時(shí)間對(duì)枸杞多糖得率影響的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.7 Response surface plot and contour plot of the effects of the extracting tem perature and time on the yield of LBP

3 結(jié)論

通過單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，以及在此基礎(chǔ)上通過設(shè)計(jì)3因素3水平響應(yīng)面分析法實(shí)驗(yàn)，最終確定出枸杞多糖的提取最佳工藝參數(shù)：料液比1:27g/mL、浸提溫度81℃、提取時(shí)間2.5h。在此工藝條件下提取的枸杞得率較高，實(shí)際得率可達(dá)5.03%。

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