杜開先,羅予,張燕,董燕

(1.鄭州大學第三附屬醫(yī)院小兒神經內科,鄭州 450052;2.河南省醫(yī)藥科學研究院免疫研究室,鄭州 450052; 3.河南省紅十字血液中心檢驗科,鄭州 450003)

林可霉素對小鼠腸道屏障作用的影響*

杜開先1,羅予2,張燕3,董燕1

(1.鄭州大學第三附屬醫(yī)院小兒神經內科,鄭州 450052;2.河南省醫(yī)藥科學研究院免疫研究室,鄭州 450052; 3.河南省紅十字血液中心檢驗科,鄭州 450003)

目的 觀察鹽酸林可霉素對小鼠腸黏膜屏障的損傷作用。方法將24只小鼠均分為正常對照組和造模組。造模組給予鹽酸林可霉素灌胃,建立小鼠腸黏膜破損及腸道菌群失調模型。檢測兩組小鼠腸道菌群,分析細菌易位及通透性情況[檢測血漿二胺氧化酶(DAO)]。結果小鼠灌服鹽酸林可霉素3 d,腸道菌群失調。正常對照組需氧菌易位率16.7%,造模組52.3%;正常對照組厭氧菌易位率8.3%,造模組68.2%。上述指標比較,造模組均顯著高于正常對照組,且差異有統計學意義(P＜0.01)。正常對照組血漿DAO(2.08±0.05)mg·mL-1,造模組(7.18± 0.10)mg·mL-1,造模組高于正常對照組,差異有統計學意義(P＜0.01)。結論鹽酸林可霉素對小鼠腸黏膜屏障有損傷作用。

林可霉素;腸道菌群;黏膜屏障

抗菌藥物的廣泛和長期應用,導致腸道菌群紊亂日益受到關注。腸道屏障由理化、生物、機械、免疫等屏障構成,任何屏障受損腸道黏膜通透性就會增加[1]。腸道菌群失調可導致腸道屏障受損,引起繼發(fā)性感染,嚴重者可危及患者生命。鹽酸林可霉素屬于窄譜抗菌藥物,臨床廣泛用于治療各種感染,尤其是厭氧菌感染。已有研究表明,鹽酸林可霉素短期大量給藥可造成小鼠菌群失調,腸道組織損傷,免疫功能受損[2-3]。筆者在本實驗中探討鹽酸林可霉素對實驗動物腸道屏障通透性的影響,旨在為臨床合理用藥提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 動物 昆明種小鼠,清潔級,體質量18～22 g,平均(20.00±1.24)g,雌雄各半。河南省實驗動物中心提供,動物生產許可證號:SCXK(豫)2010-002,動物使用許可證號:SYXK(豫)2011-0010,實驗動物合格證號:SCXK(豫)2005-0001。

1.2 藥物與試劑 鹽酸林可霉素注射液(300 g·L-1,上海旭東海普藥業(yè)有限公司,批號: 070509),鄰苯二茴香胺(O-dianisidine,Sigma公司,批號:102175464,純度:99%),辣根過氧化酶(peroxidase-horseradish,Sigma公司,批號:102065348,純度:RZ≥150 μg·mL-1),鹽酸戊二胺(cadaverinedihydrochloride,Sigma公司,批號:101098572,純度≥98%),二胺氧化酶標準品(diamine oxidase,DAO, Sigma公司,批號:1001145922,靈敏度: 3.9 mU·mL-1)。

1.3 培養(yǎng)液 伊紅美蘭培養(yǎng)液(eosin methylene blue medium,EMB),腸球菌選擇性培養(yǎng)液(enterococcus selective medium,EC),乳酸桿菌選擇性培養(yǎng)液(lactobacilli select medium,LBS),類桿菌選擇性培養(yǎng)液(bacteroides selective medium,BD),雙歧桿菌選擇性培養(yǎng)液(bifidobacterium selec medium,Blb)[4]。上述培養(yǎng)液均按照參考文獻[4]自行配置。

1.4 儀器與設備 紫外分光光度計(PE Lambda 35),厭氧罐(英國OXOID,HP 0011A)。

1.5 腸黏膜損傷模型建立 取小鼠20只,灌胃鹽酸林可霉素,4 mg·kg-1,bid,共5 d。每天觀察小鼠神態(tài)、大便情況,隨機處死4只小鼠,裸眼觀察小鼠腸黏膜完整性,以小鼠腸黏膜出現潰瘍破損為腸黏膜損傷[3]。

1.6 對腸道屏障作用的影響 取小鼠12只作為正常對照組,灌服0.9%氯化鈉溶液;另取小鼠12只造模,灌服鹽酸林可霉素。均4 mg·kg-1,bid,連續(xù)3 d后處死,檢測各項指標。

1.7 腸道菌群的檢測 取小鼠鮮糞便約0.2 g,加無菌0.9%氯化鈉溶液制成10倍稀釋液,振蕩均質,稀釋至10-6,取25 μL分別滴種各選擇性培養(yǎng)液,EMB及EC置孵箱35℃培養(yǎng)16～24 h后計數,Blb、LBS和BD置厭氧罐35℃培養(yǎng)48～72 h后計數[3],計算各菌每克糞便中菌落形成單位(CFU·g-1)。

1.8 細菌易位檢測 將小鼠浸泡于70%乙醇內1 h,在超凈工作臺內無菌取肝臟、肺臟、腎臟及腹腔液,分別置增菌液中培養(yǎng),每種器官標本分別進行需氧和厭氧培養(yǎng),觀察細菌生長結果。需氧培養(yǎng)24 h后,涂片觀察,并接種于EMB和EC培養(yǎng)液上,24 h后觀察結果。以EMB或EC培養(yǎng)液平板生長有菌落為該器官需氧菌生長陽性。厭氧培養(yǎng)48 h后涂片觀察,并接種于LBS、BD和Blb培養(yǎng)液,24 h后觀察并涂片鑒定。以LBS或BD或Blb培養(yǎng)液平板生長有菌落,且為厭氧菌者為該器官厭氧菌生長陽性,計算易位率。易位率(%)=陽性器官個數/(小鼠數×4)×100%。

1.9 血漿DAO的測定 摘眼球取血,離心,血清置于-80℃冰箱保存,分光光度計測定血清DAO含量[5]。

1.10 統計學方法 所有資料用SPSS12.0版統計軟件包進行處理,計量資料以均數±標準差(±s)表示,獨立樣本t檢驗,計數資料組間比較采用χ2檢驗,按α=0.05水準,P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 腸黏膜損傷模型 鹽酸林可霉素灌胃第2天,小鼠反應差,大便軟,第3天至第5天均出現小鼠腸黏膜破損和炎癥遞質滲出。

2.2 腸道菌群的定量檢測 與正常對照組比較,造模組5種腸道菌群發(fā)生顯著變化,其中雙歧桿菌、乳酸桿菌、腸桿菌數量顯著降低,而腸球菌、類桿菌數量有所升高,見表1。

2.3 細菌易位率 正常對照組小鼠細菌易位較少,需氧菌為16.7%,厭氧菌為8.3%;造模組細菌易位率,需氧菌為52.3%,厭氧菌為68.2%。造模組均顯著高于正常對照組,且差異有統計學意義(P＜0.05)。

2.4 腸黏膜通透性 正常對照組外周血DAO為(2.08±0.05)mg·mL-1,造模組DAO含量為(7.18± 0.10)mg·mL-1,造模組顯著高于正常對照組(P＜0.01)。

3 討論

感染性疾病的主要治療手段是合理應用抗菌藥物,但長期大量應用抗菌藥物易導致腸道微生態(tài)失調,引起二重感染,給治療帶來新的困難。腸道中的雙歧桿菌、乳酸桿菌等是有益菌[6]。正常情況下,雙歧桿菌、類桿菌、乳酸桿菌等是腸道中優(yōu)勢菌;菌群紊亂時,雙歧桿菌、乳酸桿菌數量減少,它們與條件致病菌的數量變化可作為腸道菌群失調程度的判斷標準。在腸道菌群失調性腹瀉時,球菌數量顯著增加并多于桿菌數量。楊曉燕等[7]研究表明,乳糖酸紅霉素、頭孢氨芐、鹽酸林可霉素及氨芐西林鈉均能導致小鼠腸道菌群失調,其中鹽酸林可霉素的作用穩(wěn)定而持久。謝莉敏等[3]研究表明低劑量灌胃鹽酸林可霉素可用于制備小鼠腸道菌群失調模型,高劑量給藥可對小鼠機體造成損害。本實驗應用鹽酸林可霉素造成小鼠腸道菌群失調和腸黏膜破損模型,腸道菌群嚴重失調,其中腸道有益菌(雙歧桿菌、乳酸桿菌)大量下降,而腸桿菌、類桿菌和腸球菌大幅度升高。腸道屏障中的生物屏障受到損傷。

表1 兩組腸道菌群檢測結果Tab.1 Results of test on intestinal flora in two groups logCFU·g-1,±s

表1 兩組腸道菌群檢測結果Tab.1 Results of test on intestinal flora in two groups logCFU·g-1,±s

與正常對照組比較,*1P＜0.05Compared with normal control group,*1P＜0.05

組別腸桿菌腸球菌雙歧桿菌乳酸桿菌類桿菌正常對照組6.36±0.355.83±0.329.56±0.199.98±0.387.38±0.23造模組8.13±0.32*17.07±0.41*16.67±0.08*17.09±0.14*18.87±0.17*1

DAO是一種具有高度活性的細胞內酶,存在于哺乳動物的黏膜和絨毛上層細胞中,以空腸、回腸絨毛上皮細胞中含量最高,活性較強,而在其他組織中,含量較少,活性也低[5]。當腸黏膜上皮細胞受損壞死后該酶釋放被吸收入血,導致血漿和腸腔中DAO升高,而腸黏膜DAO活性降低。因此,可以通過測定外周血中DAO含量的變化,來反映腸黏膜上皮細胞的損傷和腸黏膜上皮細胞損傷后的修復情況。本實驗中,正常對照組血清中DAO的含量為2.08 mg·mL-1,經鹽酸林可霉素灌胃后上升至7.18 mg·mL-1,表明腸黏膜受損嚴重。腸道屏障中的機械屏障受到損傷。

細菌移位是指由于腸道屏障功能受損而使腸道內細菌進入肝、脾、淋巴結以至全身血液循環(huán)的過程[8]。腸道是重癥感染病原菌的儲存庫,在正常情況下,各菌群經常會有少量細菌向周圍發(fā)生橫向或縱向轉移,但由于數量少,以及原籍菌的生物拮抗作用和宿主的免疫機制,不會轉移成功?？咕幍拇罅块L期使用、不合理用藥、長期禁食、器官移植、應激等,可導致腸道微生態(tài)破壞,機體免疫力降低,腸道動力下降,條件致病菌過度繁殖,轉移菌數量過大,易位就成為可能。本實驗結果表明,正常小鼠腸道細菌向臟器的易位率需氧菌為16.7%,厭氧菌為8.3%;經鹽酸林可霉素灌胃后腸道細菌易位到各臟器的細菌增加,易位率明顯增加,需氧菌為52.3%,厭氧菌為68.2%。所以維持腸道內環(huán)境穩(wěn)態(tài),保護機體免受病原微生物入侵顯得尤為重要[9]。

[1] HECHT G.Innate mechanisems of epithelial host defense; spotlight on intestine[J].Am J Physiol,1999,277(3 Pt 1): C351-C358.

[2] 鄺棗園,高智群,張韌,等.鹽酸林可霉素造成小鼠腸道菌群失調規(guī)律的研究[J].吉林醫(yī)學,2009,30(13):1230-1231.

[3] 謝莉敏,李丹,程秀芳,等.鹽酸林可霉素對小鼠腸道菌群的影響[J].安徽農業(yè)科學,2013,41(9):3913-3914.

[4] 羅予,馮羨菊.臨床厭氧菌檢測及圖解[M].北京:中國協和醫(yī)科大學出版社,2007:74-99.

[5] 黎君友,于燕.分光光度法測定血和小腸組織二胺氧化酶活性[J].氨基酸和生物資源,1996,18(4):28.

[6] 黃煌,鄭鵬遠,羅予.雙歧桿菌對免疫功能低下小鼠腸道屏障功能的影響[J].臨床醫(yī)學,2012,32(5):1-3.

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[9] 王堅鏹,湯瑾,蔣燕群.益生菌對大鼠腸道菌群紊亂和細菌易位的影響[J].上海交通大學學報:醫(yī)學版,2006,26 (2):163-165.

DOI 10.3870/yydb.2014.11.008

《中國實驗方劑學雜志》是由國家中醫(yī)藥管理局主管、中國中醫(yī)科學院中藥研究所和中國中西醫(yī)結合學會中藥專業(yè)委員會主辦的學術刊物,已成為“中國中文核心期刊”、“中國科技論文統計源期刊(2013年擴刊版)”、“中國學術期刊綜合評價數據庫來源”期刊、“中國期刊網、中國學術期刊光盤版”全文收錄期刊、美國《化學文摘》統計源期刊;并被評為“中國中醫(yī)藥優(yōu)秀期刊”及“中國學術期刊優(yōu)秀期刊”。該刊創(chuàng)建于1995年10月,主要設置欄目:學術專論、綜述、工藝與制劑、化學與分析、藥物代謝、藥理、毒理、臨床、數據挖掘等。讀者對象是從事中西醫(yī)藥,尤其是方劑教學、科研、醫(yī)療、生產的高、中級工作者,以及中醫(yī)藥院校的高年級學生等。

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Effect of Lincomycin on the Intestinal Mucosa Barrier of Mice

DU Kai-xian1,LUO Yu2,ZHANG Yan3,DONG Yan1
(1.Department of Pediatrics,the Third Affiliated Hospital, Zhengzhou University,Zhengzhou 450052,China;2.Henan Academy of Medical and Pharmaceutical Science, Zhengzhou,450052 China;3.Department of Clinical Laboratory,Henan Province Red Cross Blood Center, Zhengzhou 450003,China)

ObjectiveTo study the effect of lincomycin hydrochloride on the intestinal mucosal barrier of mice.MethodsA total of 24 mice were equally and randomly divided into normal control group and model group.Mice in the model group were administered with 8 mg·kg-1·d-1of lincomycin hydrochloride through gastric lavage for 3 days to establish the model of intestinal mucosa injury and alteration of intestinal flora in mice.The intestinal flora was tested,bacterial translocation was analyzed,and mucosa permeability was determined by measuring diamine oxidase(DAO)in plasma.ResultsLincomycin hydrochloride led to alteration of intestinal flora in mice after oral administration for three days in mice.The aerobes translocation rate was 16.7%and 52.3%in the normal and model groups,respectively(P＜0.01).The anaerobes translocation rate was 8.3%and 68.2%in the normal and model groups,respectively(P＜0.01).The plasma concentration of diamine oxidase was increased from(2.08±0.05)mg·mL-1in the normal group to(7.18±0.10)mg·mL-1in the model group(P＜0.01).ConclusionLincomycin hydrochloride damages intestinal mucosal barrier in mice.

Lincomycin;Intestinal flora;Intestinal mucosal barrier

R978.1;R969

A

1004-0781(2014)11-1131-03

2013-08-28

2013-09-20

*河南省屬科研單位社會公益預研項目(0641130102)

杜開先(1972-),男,河南民權人,副教授,碩士生導師,碩士,研究方向:小兒神經系統疾病與微生態(tài)。電話: 0371-66903322,E-mail:dukaixian@126.com。

羅予(1957-),男,河南鄭州人,研究員,碩士生導師,學士,主要研究方向:腸道微生態(tài)。電話:0371-66658226,E-mail:hnwst_2006@aliyun.com。