金巖,黃山,趙磊,裴小娜

[1.青島科技大學(xué)化工學(xué)院藥學(xué)系,青島 266042;2.甘肅中醫(yī)學(xué)院甘肅省高校中(藏)藥化學(xué)與質(zhì)量研究省級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,蘭州 730000]

松生等總黃酮提取工藝及鎮(zhèn)痛抗炎作用研究*

金巖1,黃山1,趙磊2,裴小娜1

[1.青島科技大學(xué)化工學(xué)院藥學(xué)系,青島 266042;2.甘肅中醫(yī)學(xué)院甘肅省高校中(藏)藥化學(xué)與質(zhì)量研究省級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,蘭州 730000]

目的 研究松生等總黃酮的最佳優(yōu)化提取工藝,并對(duì)不同極性溶劑提取部分的鎮(zhèn)痛抗炎作用進(jìn)行研究。方法通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn),考察提取時(shí)間、料液比、乙醇濃度和提取次數(shù)對(duì)松生等總黃酮提取率的影響;采用小鼠冰醋酸扭體法及二甲苯致小鼠耳腫脹模型篩選松生等不同溶劑提取部分鎮(zhèn)痛抗炎作用。結(jié)果回流提取法提取松生等總黃酮的最佳條件為:提取時(shí)間3 h、料液比1∶30、乙醇濃度60%、提取2次,黃酮提取率最高5.63%;松生等乙醇提取物、正丁醇提取物和乙酸乙酯提取物均能夠抑制冰醋酸引起的小鼠扭體反應(yīng)和二甲苯引起的小鼠耳腫脹。結(jié)論該工藝提取松生等總黃酮提取率高,方法簡(jiǎn)便,重復(fù)性好。松生等乙醇提取物、正丁醇提取物和乙酸乙酯提取物均具有明顯鎮(zhèn)痛抗炎作用。

松生等;總黃酮;回流提取;鎮(zhèn)痛;抗炎

松生等(Euphorbia prolifera)為鼠李科植物西藏貓乳(Rhamnella gilgiticaMansf.et Melch.)或小葉鼠李(Rhamnus parvifoliaBunge)的干燥木材[1]。原植物主產(chǎn)于我國(guó),主要分布在西藏東南部、云南西北部、四川西南部,為我國(guó)藏族傳統(tǒng)民間用藥,具有涼血、祛風(fēng)濕、抗炎、消腫止痛功能,用于治療高山多血癥、麻風(fēng)病等疾病。但目前對(duì)該藥研究較少,僅在20世紀(jì)90年代有少量文獻(xiàn)記載其主要成分為黃酮類(lèi)化合物[2-3]。筆者在本實(shí)驗(yàn)研究松生等總黃酮的最佳提取工藝,并通過(guò)冰醋酸誘導(dǎo)小鼠扭體實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ秃投妆秸T導(dǎo)小鼠耳腫脹模型比較不同溶劑提取部分的鎮(zhèn)痛抗炎作用。

1 材料與儀器

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 實(shí)驗(yàn)ICR小鼠,體質(zhì)量(20±2)g,雌雄兼用,由青島藥物檢驗(yàn)所提供,SPF級(jí),生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(魯)2009007,使用許可證號(hào):SYXK(魯) 20092-009。

1.2 藥物與試劑 松生等采自西藏芒康地區(qū),由成都中醫(yī)藥大學(xué)龍飛副教授鑒定為鼠李科貓乳屬植物西藏貓乳莖的干燥木質(zhì)部;蘆丁對(duì)照品購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院(含量≥98%,批號(hào):100080-200707);乙醇(天津博迪化工股份有限公司,分析純,批號(hào): 20121019);冰醋酸(天津博迪化工股份有限公司,分析純,批號(hào):20120524);二甲苯(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司,分析純,批號(hào):20121103)。

1.3 儀器與設(shè)備 98-1-B型電子調(diào)溫電熱套(上海百申儀器設(shè)備有限公司);YP402N電子天平(北京京海正通科技有限公司);B-220恒溫水浴鍋(鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司);P7021TP-6格蘭仕微波爐(廣東格蘭仕集團(tuán)有限公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 總黃酮的含量測(cè)定

2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制 取105℃減壓干燥的蘆丁對(duì)照品11.7 mg精密稱(chēng)定,乙醇溶解,定容至25 mL,搖勻,配成0.468 mg·mL-1蘆丁對(duì)照品溶液。分別量取此溶液1.0,2.0,3.0,4.0,5.0 mL,置25 mL量瓶,分別加水6 mL,后加5%亞硝酸鈉1 mL,振搖后放置6 min,再加入10%硝酸鋁1 mL。搖勻后靜置6 min,最后加入4%氫氧化鈉10 mL,加水至刻度,搖勻,靜置15 min,在510 nm波長(zhǎng)下測(cè)吸光度(UV-1000紫外可見(jiàn)分光光度計(jì),北京萊伯泰科儀器有限公司)。以蘆丁濃度(μg·mL-1)為橫坐標(biāo),吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn),得線(xiàn)性回歸方程為:A=12.759C-0.037 3,r= 0.999 5,表明蘆丁在18.72～93.60 μg·mL-1呈良好線(xiàn)性關(guān)系。

2.1.2 供試品溶液的制備 取干燥至恒重的松生等干燥物100 mg,精密稱(chēng)定,置干燥小燒杯,加適量70%乙醇,加熱溶解。用濾膜過(guò)濾溶液并將其轉(zhuǎn)入25 mL量瓶,加超純水定容,搖勻,即得供試品溶液。

2.2 單因素分析

2.2.1 料液比對(duì)提取率的影響 稱(chēng)取粉碎后的松生等5.0 g,以70%乙醇為提取劑,提取4 h,選擇料液比1∶20,1∶30,1∶40,1∶50條件下進(jìn)行回流提取實(shí)驗(yàn),測(cè)定并計(jì)算相應(yīng)條件下總黃酮得率,考察不同料液比對(duì)提取率的影響,結(jié)果見(jiàn)表1。

由表1可知,隨料液比中乙醇量增加,黃酮浸出率也依次增加,當(dāng)料液比為1∶30(g·mL-1)時(shí),達(dá)到最高,乙醇量繼續(xù)增加,黃酮浸出率有所下降,可能因?yàn)橛写罅侩s質(zhì)溶出,影響了黃酮浸出率,而且過(guò)大的料液比會(huì)造成溶劑和資源浪費(fèi),增加成本。綜合考慮,確定料液比1∶30為最佳料液比。

表1 不同料液比對(duì)提取率的影響Tab.1 Effect of the ratio of material to liquid on extraction rate

2.2.2 提取時(shí)間對(duì)提取率的影響 稱(chēng)取粉碎后的松生等5.0 g,70%乙醇為提取劑,料液比為1∶30,提取時(shí)間分別為2,3,4,5 h,回流提取2次。研究不同提取時(shí)間對(duì)提取率的影響。見(jiàn)表2。

表2 提取時(shí)間對(duì)提取率的影響Tab.2 Effect of extraction time on extraction rate

由表2可知,提取率隨提取時(shí)間的延長(zhǎng)出現(xiàn)先增加后逐漸降低的現(xiàn)象,當(dāng)提取時(shí)間為4 h時(shí)達(dá)到最大值?？赡芤?yàn)樗S酮物質(zhì)已基本析出,延長(zhǎng)提取時(shí)間不能使提取率升高。另外,延長(zhǎng)提取時(shí)間致使環(huán)境溫度過(guò)高,部分乙醇溶劑揮發(fā)從而影響提取效果,因此選擇提取時(shí)間4 h最佳。

2.2.3 乙醇濃度對(duì)提取率的影響 稱(chēng)取粉碎后的松生等5.0 g,料液比為1∶30,提取時(shí)間4 h,分別以50%,60%,70%,80%乙醇為提取溶劑進(jìn)行回流提取實(shí)驗(yàn),提取2次。結(jié)果見(jiàn)表3。

結(jié)果表明,隨乙醇濃度增加,提取率先增加后減小,70%乙醇提取率最高,之后提取率下降,這可能是由于一些醇溶性雜質(zhì)、親脂性強(qiáng)的成分溶出增多,干擾因素隨之增多,從而導(dǎo)致黃酮類(lèi)化合物浸出率下降。所以最佳提取乙醇濃度為70%。

2.2.4 提取次數(shù)對(duì)提取率的影響 稱(chēng)取粉碎后的松生等5.0 g,以70%乙醇為提取劑、提取時(shí)間4 h、液料比1∶30條件下進(jìn)行回流提取實(shí)驗(yàn),測(cè)定并計(jì)算相應(yīng)條件下總黃酮得率,考察提取次數(shù)對(duì)提取率的影響,結(jié)果見(jiàn)表4。

表3 乙醇濃度對(duì)提取率的影響Tab.3 Effect of ethanol concentration on extraction rate %

表4 提取次數(shù)對(duì)提取率的影響Tab.4 Effect of extraction times on extraction rate

2.3 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù)上述單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果,選擇料液比(A)、提取時(shí)間(B)、乙醇濃度(C)、提取次數(shù)(D)為考察因素,以總黃酮提取率為評(píng)價(jià)指標(biāo),采用L9(34)正交表對(duì)回流提取條件做進(jìn)一步優(yōu)選,因素水平見(jiàn)表5,實(shí)驗(yàn)結(jié)果及方差分析見(jiàn)表6,7。

表5 正交實(shí)驗(yàn)因素水平表Tab.5 Factors and levels of orthogonal test

由表6和表7可知,各因素對(duì)松生等總黃酮提取率影響順序?yàn)樘崛r(shí)間>料液比>提取次數(shù)>乙醇濃度,其中提取時(shí)間為最主要影響因素,各因素最佳組合為A2B2C1D2,即加入60%乙醇溶液,料液比為1∶30,回流提取2次,提取時(shí)間3 h,所得提取率最高。

表6 L9(34)正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Tab.6 Design and results of L9(34)orthogonal test

表7 正交實(shí)驗(yàn)方差分析表Tab.7 Variance analysis on orthogonal test

驗(yàn)證實(shí)驗(yàn):精密稱(chēng)取松生等樣品5.0 g,2份,按照A2B2C1D2條件回流提取,測(cè)得松生等中總黃酮的提取率為5.62%和5.64%,平均提取率5.63%。

2.4 松生等不同極性提取物鎮(zhèn)痛抗炎作用研究

2.4.1 松生等不同極性提取物的制備 松生等去皮木部1 kg,75%乙醇3倍回流提取3次,濾過(guò)、回收乙醇提取液,得浸膏。將浸膏水溶液依次用乙酸乙酯、正丁醇進(jìn)行萃取,直至萃取溶液無(wú)色為止,回收溶劑,即得不同溶劑的萃取物。

2.4.2 松生等不同提取物對(duì)冰醋酸所致小鼠扭體的影響 取小鼠40只,雌雄各半,體質(zhì)量(20±2)g,隨機(jī)分為模型對(duì)照組、松生等乙醇提取物組、松生等正丁醇提取物組和松生等乙酸乙酯提取物組,每組10只。模型對(duì)照組每天給予0.9%氯化鈉溶液0.02 mL·g-1。其余各組每天分別給予等量松生等乙醇提取物、正丁醇提取物和乙酸乙酯提取物,連續(xù)灌胃3 d。末次給藥30 min后,每只小鼠腹腔注射0.6%醋酸0.02 mL·g-1,觀察10 min內(nèi)扭體次數(shù)及扭體潛伏期,進(jìn)行組間t檢驗(yàn)[4]。見(jiàn)表8。

結(jié)果表明:松生等3種提取物與模型對(duì)照組比較,均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,說(shuō)明三者均有一定鎮(zhèn)痛作用。其中正丁醇提取物組和乙酸乙酯提取物組鎮(zhèn)痛效果略高于乙醇提取物組。

2.4.3 松生等不同提取物對(duì)二甲苯所致小鼠耳腫脹的影響 取小鼠40只,雌雄各半,體質(zhì)量(20±2)g,隨機(jī)分為模型對(duì)照組、松生等乙醇提取物組、松生等正丁醇提取物組和松生等乙酸乙酯提取物組,每組10只。每組動(dòng)物實(shí)驗(yàn)前灌胃給藥,模型對(duì)照組給予0.9%氯化鈉溶液,0.02 mL·g-1,其余各組分別給予等量松生等乙醇提取物、正丁醇提取物和乙酸乙酯提取物,連續(xù)給藥5 d。末次給藥1 h后,每只小鼠右耳內(nèi)外側(cè)涂二甲苯50 μL致炎,左耳不涂為正常耳對(duì)照,30 min后脫頸處死,沿耳廓基線(xiàn)剪下雙耳,用耳腫打孔器沖下左耳及右耳同一部位的圓片,立即在分析天平上稱(chēng)質(zhì)量,以?xún)啥|(zhì)量差作為腫脹度,進(jìn)行組間差異性比較,計(jì)算耳廓腫脹率和腫脹抑制率。腫脹度(%)=(右耳質(zhì)量-左耳質(zhì)量)/左耳質(zhì)量×100%[5];腫脹抑制率(%) =(模型對(duì)照組耳腫脹率-給藥組耳腫脹率)/模型對(duì)照組耳腫脹率×100%[5-6]。結(jié)果見(jiàn)表9。

實(shí)驗(yàn)表明,松生等3種提取物給藥后均可以降低二甲苯致小鼠耳腫脹,與模型對(duì)照組比較,均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,而組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,說(shuō)明三者均有一定抗炎作用。其中乙醇提取物組抗炎效果略高于正丁醇提取物組和乙酸乙酯提取物組。

表8 4組小鼠鎮(zhèn)痛作用實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.8 Results of analgesia experiment on four groups of mice ±s

表8 4組小鼠鎮(zhèn)痛作用實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.8 Results of analgesia experiment on four groups of mice ±s

與模型對(duì)照組比較,*1P＜0.05,*2P＜0.01Compared with model group,*1P＜0.05,*2P＜0.01

組別小鼠/只劑量/(g·kg-1)潛伏期/min10 min內(nèi)扭體/次鎮(zhèn)痛抑制率/%模型對(duì)照組10…7.62±2.0930.14±8.61…松生等乙酸乙酯提取物組105.854.79±1.35*111.21±7.52*263.49乙醇提取物組105.855.93±2.40*122.52±10.23*125.99正丁醇提取物組105.853.07±0.17*29.72±5.31*268.10

表9 松生等不同提取物對(duì)二甲苯所致小鼠耳腫脹的影響Tab.9 Effect of different extracts of Euphorbia prolifera on ear edema induced by xylene in mice ±s

表9 松生等不同提取物對(duì)二甲苯所致小鼠耳腫脹的影響Tab.9 Effect of different extracts of Euphorbia prolifera on ear edema induced by xylene in mice ±s

與模型對(duì)照組比較,*1P＜0.05,*2P＜0.01Compared with model group,*1P＜0.05,*2P＜0.01

組別小鼠/只劑量/ (g·kg-1)腫脹度/ mg腫脹抑制率/%模型對(duì)照組10…5.88±0.61…乙酸乙酯提取物組105.853.33±2.02*143.41乙醇提取物組105.852.62±1.12*255.44正丁醇提取物組105.853.70±1.04*237.12

3 討論

本研究采用乙醇回流提取法提取松生等總黃酮[7-9],通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)考察了液料比、提取時(shí)間、乙醇濃度、提取次數(shù)對(duì)總黃酮提取率的影響,確定了正交實(shí)驗(yàn)的4個(gè)水平。通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)及結(jié)果分析,可以得出各因素對(duì)松生等黃酮類(lèi)化合物提取影響大小順序?yàn)樘崛r(shí)間>料液比>提取次數(shù)>乙醇濃度。最終確定的最佳提取工藝為A2B2C1D2。即加入60%乙醇溶液,料液比1∶40,回流提取2次,提取時(shí)間3 h最合適。采用本正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)選的最佳工藝條件進(jìn)行驗(yàn)證,其提取率可達(dá)5.63%,表明該工藝重現(xiàn)性好,提取率高。

本實(shí)驗(yàn)采用醋酸致小鼠扭體模型來(lái)觀察松生等黃酮提取物的鎮(zhèn)痛效果,其中松生等正丁醇提取物的疼痛控制率最高。松生等的主要有效成分為黃酮類(lèi)化合物,對(duì)松生等黃酮類(lèi)化合物的鎮(zhèn)痛作用筆者尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。本研究在醋酸致小鼠扭體反應(yīng)模型上,證明松生等黃酮提取物具有一定的鎮(zhèn)痛效果,這為臨床上使用松生等治療炎癥性疾病,緩解疼痛癥狀提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。但松生等提取物的鎮(zhèn)痛作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

炎癥是機(jī)體對(duì)組織損傷或致病因子侵入所產(chǎn)生的以防御為主的反應(yīng)。作用在于殺滅微生物、清除異物和自身傷亡細(xì)胞或組織,以防止損傷擴(kuò)大并促進(jìn)受損組織修復(fù)[10]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀察典型的二甲苯致炎小鼠耳廓腫脹模型證明了松生等提取物的抗炎作用。結(jié)果表明,松生等提取物對(duì)二甲苯致小鼠耳廓腫脹具有明顯的抑制作用。

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DOI 10.3870/yydb.2014.11.003

《中國(guó)醫(yī)院藥學(xué)雜志》系中國(guó)科協(xié)主管、中國(guó)藥學(xué)會(huì)主辦的綜合性醫(yī)院藥學(xué)專(zhuān)業(yè)性學(xué)術(shù)核心期刊。該刊為湖北省優(yōu)秀期刊,2008年中國(guó)科協(xié)精品科技期刊,主要面向全國(guó)醫(yī)院藥學(xué)工作者、醫(yī)務(wù)人員和廣大藥學(xué)工作者,主要介紹國(guó)內(nèi)外醫(yī)院藥學(xué)創(chuàng)新性成果、藥學(xué)先進(jìn)技術(shù)、臨床合理用藥、中西藥制劑、藥劑科的科學(xué)管理與改革、藥學(xué)基礎(chǔ)知識(shí)及理論等。

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Analgesia and Anti-inflammatory Effect of Total Flavonoids Extracted from Euphorbia prolifera

JIN Yan1,HUANG Shan1,ZHAO Lei2,PEI Xiao-na1
(1.Department of Pharmacy,Chemical EngineeringInstitute,Qingdao University of Science and Technology,Qingdao 266042,China;2.Key Laboratory of Chemistry and Quality for Traditional Chinese Medicines of the College of Gansu Province,Gansu College of Traditional Chinese Medicine,Lanzhou 730000,China)

ObjectiveThe study aimed to investigate the best extraction process and the analgesia and antiinflammatory properties of total flavonoids fromEuphorbia prolifera.MethodsThrough single factor experiment and orthogonal test,factors that affect the extraction yield of total flavonoids were studied,including the extraction time,solid to liquid ratio, ethanol concentration and extraction times.The mice models of ear edema induced by xylene and twisting induced by acetic acid were used to evaluate the analgesia and anti-inflammatory effects of different extractions fromEuphorbia prolifera.ResultsTotal flavonoids were extracted by the refluxing method,and the optimum conditions were extracting for 3 hours,solid to liquid ratio of 1∶30,ethanol content of 60%in the solvent,and processed for 2 times.The highest extraction yield of total flavonoids fromEuphorbia proliferawas 5.63%.The ethanol,ethyl acetate and n-butanol extracts decreased twisting and ear swelling in mice.ConclusionThe extraction for total flavonoids fromEuphorbia proliferais simple,efficient and reproducible.The ethanol,ethyl acetate and n-butanol extracts of total flavonoids have obvious analgesia and anti-inflammatory effects.

Euphorbia prolifera;Total flavonoids;Reflux extraction;Analgesia;Anti-inflammation

R286;R965

A

1004-0781(2014)11-1411-05

2013-09-06

2013-10-25

*國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81360686);甘肅省教育廳碩士生導(dǎo)師項(xiàng)目(1106-02)

金巖(1978-),女,山東青島人,講師,博士,從事天然藥物修飾及藥理活性研究。E-mail:qaz309@126.com。

趙磊(1967-),女,甘肅定西人,教授,博士,從事中藥化學(xué)研究。E-mail:luckleizhao@126.com。