任漢城，趙海龍

(浙江金立源藥業(yè)有限公司，上虞 312300)

高效液相色譜法測定阿托伐他汀鈣中間體L1的相關(guān)物質(zhì)

任漢城，趙海龍

(浙江金立源藥業(yè)有限公司，上虞 312300)

目的 建立高效液相色譜法測定阿托伐他汀鈣中間體L1的有關(guān)物質(zhì)。方法采用Agilent Poroshell ECC18色譜柱(100 mm×4.6 mm,2.7 μm),以水∶乙腈∶四氫呋喃∶甲醇(36∶8.4∶29∶26.6,為流動(dòng)相,流速為0.7 mL·min-1,檢測波長為246 nm,柱溫為30℃。結(jié)果阿托伐他汀鈣中間體L1和已知雜質(zhì)L1-雙胺、L1-脫氟、L1-R,S、L1-雙氟互相之間分離度良好,L1-雙胺在0.124 1～1.488 0 μg·mL-1的濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系(R2=0.999 5,n=7),L1-脫氟在0.386 6～3.093 0 μg·mL-1的濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系(R2=1,n=6),L1-R,S在0.357 1～2.856 0 μg·mL-1的濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系(R2=0.999 0,n=6),L1-雙氟在0.187 3～1.498 0 μg·mL-1的濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系(R2=0.999 3,n=6),各雜質(zhì)的控制限度均達(dá)到定量限。結(jié)論該方法各雜質(zhì)及中間體L1互相之間分離度良好,方法準(zhǔn)確、可靠。

阿托伐他汀鈣中間體；色譜法,高效液相；有關(guān)物質(zhì)

阿托伐他汀鈣是由美國Warner-Lambert公司和Pfizer公司于1997年共同開發(fā)上市的調(diào)血脂藥,因其能夠同時(shí)降低總膽固醇和低密度脂蛋白的含量,具有高活性、低毒、低副作用等優(yōu)點(diǎn),是市場上銷售最好的HMG-CoA還原酯抑制藥。連續(xù)7年全球年銷售額達(dá)百億,其研究愈發(fā)引起人們關(guān)注[1]。中間體L1被廣泛用于合成該藥,中間體L1分子式為C11H17N3,化學(xué)名為(4R-cis)-6-[2-[2-(4-氟苯基)-5-(1-異丙基)-3-苯基-4-[(苯胺)羰基]-1H-吡咯-1-基]乙基]-2,2-二甲基-1,3-二氧六環(huán)-4-乙酸叔丁酯?？刂坪闷滟|(zhì)量是確保阿托伐他汀鈣相關(guān)雜質(zhì)低和產(chǎn)品純度高的必要前提,對(duì)于阿托伐他汀鈣原料藥生產(chǎn)過程的控制具有較重要的意義。張明穎等[2]建立了關(guān)于阿托伐他汀鈣中間體L1有關(guān)物質(zhì)的檢測方法,但作者只驗(yàn)證了主峰L1的專屬性,并未考察4種已知雜質(zhì)L1-雙胺、L1-R,S、L1-脫氟、L1-雙氟相互之間的分離度,方法有待進(jìn)一步改進(jìn)。筆者未見國內(nèi)及國外關(guān)于L1有關(guān)物質(zhì)檢查的詳細(xì)方法及其驗(yàn)證的報(bào)道。其中L1與L1-R,S由于結(jié)構(gòu)極其相似,分離難度極大,筆者建立了一個(gè)良好的分離方法,方法專屬性強(qiáng),4種已知雜質(zhì)及L1相互之間分離度良好,各雜質(zhì)與未知雜質(zhì)之間的分離度也均大于1.0,能有效地控制產(chǎn)品質(zhì)量。

1 實(shí)驗(yàn)材料

Agilent 1260高效液相色譜儀(二極管陣列檢測器)。L1、L1-R,S、L1-脫氟、L1-雙氟、L1-雙胺均為公司自制并已做結(jié)構(gòu)確證,含量按色譜純度計(jì),分別為99.09%,96.21%,100.0%,99.09%,97.53%；阿托伐他汀鈣中間體L1(公司自制,批號(hào):20100701)；乙腈、甲醇、四氫呋喃均為色譜級(jí)；水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件及系統(tǒng)適應(yīng)性實(shí)驗(yàn) 色譜柱:Agilent Poroshell EC-C18色譜柱(100 mm×4.6 mm,2.7 μm)；流動(dòng)相:水∶乙腈∶四氫呋喃∶甲醇(36∶8.4∶29∶26.6)；流速:0.7 mL·min-1；檢測波長:246 nm；柱溫:30℃；進(jìn)樣量:10 μL；溶劑:乙腈∶水(80∶20)；理論板數(shù)按L1計(jì)不少于18 000。

2.2 專屬性考察 分別配制溶劑、0.5 mg·mL-1L1供試品溶液及L1與4個(gè)雜質(zhì)的混合溶液(0.5 mg·mL-1L1+0.3%L1-R,S+0.3%L1-脫氟+ 0.15%L1-雙氟+0.10%L1-雙胺)各10 μL,在上述色譜條件下進(jìn)行測定。結(jié)果溶劑、L1及4種已知雜質(zhì)均得到良好分離。見圖1。

2.3 線性關(guān)系考察 取4種雜質(zhì)樣品適量,加溶劑溶解并稀釋成含L1-R,S2.856 0 μg·mL-1、L1-雙胺0.992 9 μg·mL-1、L1-脫氟3.093 0 μg·mL-1、L1-雙氟1.498 0 μg·mL-1的混合溶液作為200%濃度溶液,依次稀釋成150%、100%、75%、50%、25%濃度溶液,取L1-雙胺適量加溶劑溶解并稀釋成1.488 0 μg·mL-1的溶液,分別以10 μL進(jìn)樣,以濃度(C,μg·mL-1)對(duì)峰面積(A)進(jìn)行線性回歸,線性方程分別為:

結(jié)果表明L1-雙胺在0.124 1～1.488 0 μg·mL-1的濃度范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好；L1-脫氟在0.386 6～3.093 0 μg·mL-1的濃度范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好；L1-R,S在0.357 1～2.856 0 μg·mL-1的濃度范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好；L1-雙氟在0.187 3～1.498 0 μg·mL-1的濃度范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

2.4 精密度實(shí)驗(yàn) 取線性關(guān)系考察實(shí)驗(yàn)中的100%溶液,按樣品測定方法,重復(fù)測定6次,以峰面積計(jì)算: RSDL1-雙胺為2.20%,RSDL1-脫氟為0.79%,RSDL1-R,S為0.93%,RSDL1-雙氟為4.17%,均小于5.0%。

2.5 檢測限(limit of detection,LOD)及定量限(limit of quantitation,LOQ) 以信噪比3為LOD,以信噪比10為LOQ,L1-R,S的LOD為0.632 8 ng,LOQ為2.848 ng；L1-脫氟的LOD為0.685 1 ng,LOQ為3.083 ng；L1-雙氟的LOD為0.996 4 ng,LOQ為3.736 ng；L1-雙胺的LOD為0.992 8 ng,LOQ為3.723 ng。

2.6 回收率實(shí)驗(yàn) 精密稱取阿托伐他汀鈣中間體L1約25 mg 10份,精密加入各雜質(zhì)混合溶液(80%, 100%,120%各3份,不加樣1份),分別置50 mL量瓶中,溶解并稀釋至刻度,作為回收率供試液；另配制100%雜質(zhì)混合對(duì)照溶液2份。按外標(biāo)法進(jìn)行回收率測定,結(jié)果均在90%～100%,見表1。

圖1 溶劑(A)、L1(B)、L1-雙胺(C)、L1-R,S(D)、L1-雙氟(E)、L1-脫氟(F)、L1及各雜質(zhì)混合液(G)高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of diluent(A)、L1(B)、L1-diamination(C)、L1-R,S(D)、L1-difluoration(E)、L1-defluoration (F)and mixed solution of L1 and related substances(G)

表1 回收率測定結(jié)果Tab.1 Results of recovery experiment %

2.7 有關(guān)物質(zhì)檢測 取樣品約25 mg,精密稱定,于50 mL量瓶中,加溶劑溶解并稀釋至刻度,搖勻,按照本法進(jìn)行檢測,記錄色譜時(shí)間60 min,按外標(biāo)法計(jì)算各雜質(zhì)的含量,純度按面積歸一化法計(jì),結(jié)果3批樣品中有關(guān)物質(zhì)情況見表2。

3 討論

經(jīng)過詳細(xì)的實(shí)驗(yàn)研究,發(fā)現(xiàn)四氫呋喃和乙腈、甲醇對(duì)4種雜質(zhì)的分離選擇性有很大差異。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,當(dāng)流動(dòng)相為水∶乙腈∶四氫呋喃∶甲醇(36∶8.4∶29∶26.6)時(shí),主成分及4種已知雜質(zhì)互相之間能獲得理想的分離效果。

表2 3批樣品檢測結(jié)果Tab.2 Determination results of three batches of samples %

本研究采用HPLC法建立了阿托伐他汀鈣中間體L1的有關(guān)物質(zhì)檢查方法,結(jié)果表明所建立的方法準(zhǔn)確、重復(fù)性好,可用于L1的質(zhì)量控制?？刂坪弥虚g體L1的質(zhì)量是確保阿托伐他汀鈣有關(guān)物質(zhì)含量低和產(chǎn)品純度高的必要前提。本研究對(duì)于阿托伐他汀鈣原料藥生產(chǎn)過程的控制具有較重要的意義。

[1] 夏正君,馬堰啟,林送,等.阿托伐他汀鈣非對(duì)映異構(gòu)體(3S,5R)的全合成[J].廣東化工,2012,10(39):29.

[2] 張明穎,孫國祥.HPLC法測定阿托伐他汀鈣3種中間體的含量和有關(guān)物質(zhì)[J].中國藥房,2013,24(1):83.

DOI 10.3870/yydb.2014.04.026

Content Determination of Related Substances of Atorvastatin Calcium Intermediate L1 by HPLC

REN Han-cheng,ZHAO Hai-long
(Zhejiang Kinglyuan Pharmaceutical Co.,Ltd,Shangyu 312300,China)

Objective To establish a high performance liquid chromatography(HPLC)method for determination of the related substances of atorvastatin intermediate L1.MethodsThe chromatographic separation was performed on Agilent Poroshell EC-C18column(100 mm×4.6 mm,2.7 μm)with the mobile phase consisting of H2O∶ACN∶THF∶MeOH(36∶8.4∶29∶26.6).The flow rate was 0.7 mL·min-1,the detection wavelength was 246 nm,and the column temperature was 30℃.ResultsThe method achieved good separation between L1 and its related impurites including L1-defluorination,L1-R,S,and L1-diamination.The linear range was 0.124 1-1.488 0 μg·mL-1(R2=0.999 5,n=7),0.386 6-3.093 0 μg·mL-1(R2=1,n=6),0.357 1-2.856 0 μg·mL-1(R2=0.999 0,n=6),and 0.187 3-1.498 0 μg·mL-1(R2=0.999 3,n=6)for L1-diamination,L1-defluorination,L1-R,S,and L1-difluorination,respectively.The specifications of each impurity all reached the LOQ.ConclusionL1 separates well with the impurities.The method is accurate and reliable.

Atorvastatin calcium intermediate;Chromatography,high performance liquid;Related substances

R972.6;R927.2

A

1004-0781(2014)04-0498-03

2013-08-28

2013-10-25

任漢城(1984-),男,福建長汀人,助理工程師,學(xué)士,研究方向:分析方法開發(fā)。電話:(0)15857534689,E-mail：renhancheng1314@163.com。