徐靜,劉天強(qiáng),彭衡陽(yáng),肖丹,2

(1.通威股份有限公司,成都 610041;2.成都中醫(yī)藥大學(xué),成都 611137)

·藥物制劑與藥品質(zhì)量控制·

不同樣品溶劑對(duì)高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測(cè)器測(cè)定黃芪甲苷的影響*

徐靜1,劉天強(qiáng)1,彭衡陽(yáng)1,肖丹1,2

(1.通威股份有限公司,成都 610041;2.成都中醫(yī)藥大學(xué),成都 611137)

目的 考察不同樣品溶劑對(duì)高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測(cè)器(HPLC-ELSD)測(cè)定黃芪甲苷的影響。方法以黃芪和感毒清顆粒為樣品,以甲醇、90%甲醇、80%甲醇、70%甲醇、32%乙腈、15%乙腈和水為樣品溶劑,采用HPLC-ELSD測(cè)定黃芪甲苷的含量。結(jié)果以90%甲醇溶液為樣品溶劑,其系統(tǒng)適用性良好,準(zhǔn)確度、精密度、線性關(guān)系等方法學(xué)驗(yàn)證指標(biāo)符合要求。結(jié)論采用90%甲醇溶液作為樣品溶劑,更有利于黃芪及制劑中黃芪甲苷的質(zhì)量控制。

黃芪甲苷;樣品溶劑;溶劑效應(yīng);色譜,高效液相;檢測(cè)器,蒸發(fā)光散射

在反相高效液相色譜中,當(dāng)溶解樣品的溶劑(以下簡(jiǎn)稱“樣品溶劑”)較流動(dòng)相的洗脫強(qiáng)度強(qiáng)時(shí),可能產(chǎn)生峰變形、峰面積變化、柱效降低等溶劑效應(yīng)[1-2];解決方法有以流動(dòng)相或相近的溶劑溶解樣品、減小進(jìn)樣體積、以強(qiáng)溶劑(即溶劑洗脫能力比流動(dòng)性強(qiáng))溶解樣品后用等體積流動(dòng)相稀釋后進(jìn)樣或以弱溶劑溶解樣品后加大進(jìn)樣量等能夠降低樣品溶劑強(qiáng)度來(lái)消除;已報(bào)道的品種有阿魏酸、黃芩苷、青藤堿、格列奈的左旋異構(gòu)體、鹽酸小檗堿片和鹽酸環(huán)丙沙星片等[3-5]。筆者在開(kāi)展抗沙門氏菌的中草藥體外篩選試驗(yàn)研究中,為保證藥材質(zhì)量,對(duì)待篩藥材黃芪的有效成分——黃芪甲苷進(jìn)行含量測(cè)定時(shí),參照《中華人民共和國(guó)藥典》2010年版方法,均以甲醇為樣品溶解的溶劑[6-7],多次出現(xiàn)同一份樣品連續(xù)進(jìn)樣的峰面積差異大、拖尾嚴(yán)重,偶有裂峰、雙頭峰等現(xiàn)象。在排查環(huán)境條件(實(shí)驗(yàn)室溫濕度),高效液相系統(tǒng)(流動(dòng)相配比、流速、色譜柱、柱溫)和檢測(cè)器(霧化溫度、氣流速度)等因素后,認(rèn)為溶劑效應(yīng)是致此現(xiàn)象的重要因素。筆者結(jié)合系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn),以峰面積變化為主要考察指標(biāo),考察并篩選了能降低溶劑強(qiáng)度的樣品溶劑,最后進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證,旨在為黃芪及其制劑提供更優(yōu)的色譜條件。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 LC-2010AHT高效液相色譜儀(日本島津公司),2000ES檢測(cè)器(美國(guó)Alltech公司),BP211D電子天平[d=0.01 mg(80 g),d=0.1 mg(210 mg),德國(guó)賽多利斯公司],KQ5200E型超聲波清洗器(工作頻率:40 kHz,昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 試藥 黃芪甲苷(中國(guó)食品藥品檢定研究院,批號(hào):110727-200613),黃芪(成都國(guó)際商貿(mào)城荷花池中藥材專業(yè)市場(chǎng),產(chǎn)地為內(nèi)蒙古,符合《中華人民共和國(guó)藥典》2010版一部黃芪項(xiàng)下有關(guān)規(guī)定),感毒清顆粒(四川禾正制藥有限責(zé)任公司,中試樣品,批號(hào): 120314,120315,120316),乙腈為色譜純,水為超純水,其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 供試品溶液的制備 精密稱取過(guò)篩孔內(nèi)徑(250 ±9.9)μm篩的黃芪藥材粉末4 g,置索氏提取器中,加甲醇40 mL,冷浸過(guò)夜,加熱回流4 h,提取液蒸干,殘?jiān)铀?0 mL,微熱使溶解,用水飽和的正丁醇振搖提取4次,每次40 mL,合并正丁醇液,用氨試液充分洗滌2次,每次40 mL,棄去氨液,正丁醇液蒸干,殘?jiān)铀? mL使溶解,放冷。通過(guò)D101型大孔吸附樹脂柱(內(nèi)徑為1.5 cm,柱高為12 cm),以水50 mL洗脫,棄去水液,再用40%乙醇30 mL洗脫,棄去洗脫液,繼用70%乙醇80 mL洗脫,收集洗脫液,蒸干,殘?jiān)哟疾斓臉悠啡軇┒ㄈ葜? mL,過(guò)孔徑0.45μm微孔濾膜,即得供試品A溶液。取感毒清顆粒(批號(hào): 120314)和缺黃芪陰性顆粒,研細(xì),分別精密稱取4和3 g,置索氏提取器中,同法制成供試品B溶液和陰性樣品溶液[7]。

2.2 色譜條件 色譜柱:Welch UltimateTMC18(4.6 mm×250 mm,5μm);流動(dòng)相:乙腈-水(32∶68);流速:1 mL·min-1;柱溫:25℃;蒸發(fā)光檢測(cè)器的檢測(cè)參數(shù):漂移管溫度100℃,氣體流速2.8 L·min-1,撞擊器狀態(tài)為關(guān),信號(hào)放大倍數(shù)為1。

2.3 考察不同樣品溶劑對(duì)測(cè)定黃芪甲苷的影響 將“2.1”項(xiàng)下“待考察的樣品溶劑”分別擬定為“甲醇、90%甲醇、80%甲醇、70%甲醇、32%乙腈、15%乙腈和水”制成供試品溶液,并分別配制黃芪甲苷對(duì)照品溶液(約0.5 mg·mL-1)。其中樣品在甲醇、90%甲醇中完全溶解,在80%甲醇、70%甲醇、水中出現(xiàn)輕微糊化現(xiàn)象,在32%乙腈、15%乙腈中出現(xiàn)明顯糊化現(xiàn)象。照“2.2”項(xiàng)下的色譜條件,取對(duì)照品、供試品A、B和陰性溶液依次進(jìn)樣10μL,各連續(xù)進(jìn)樣5次(對(duì)照品進(jìn)樣5次是系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn)的要求,樣品進(jìn)樣5次是為了考察峰面積的變化情況),記錄色譜圖和峰面積。在各種擬定的樣品溶劑下,黃芪甲苷對(duì)應(yīng)峰的位置,供試品與對(duì)照品保留時(shí)間基本一致、陰性無(wú)干擾,分離度、理論板數(shù)等指標(biāo)良好,對(duì)應(yīng)的峰面積見(jiàn)表1。

表1 不同樣品溶劑對(duì)黃芪甲苷峰面積的影響Tab.1 Effect of different solvents on peak area of AstragaliⅣ

由表1可知,以甲醇為樣品溶劑,對(duì)樣品溶解性能良好,但其溶劑強(qiáng)度強(qiáng)于流動(dòng)相,溶劑效應(yīng)比較明顯,表現(xiàn)為峰面積不穩(wěn)定;隨著甲醇濃度的降低,溶劑效應(yīng)開(kāi)始減弱,但對(duì)樣品的溶解性能也逐漸減弱,峰面積較甲醇為樣品溶劑的峰面積明顯偏小,可能是樣品溶解不充分,黃芪甲苷有部分包裹所致。另外,以不同比例的乙腈-水(流動(dòng)相或比流動(dòng)相中有機(jī)相溶度更低的溶劑)作為樣品溶劑也可減弱溶劑效應(yīng),但對(duì)樣品的溶解性能極差,峰面積也偏小。綜合溶解性能和降低溶劑效應(yīng)等方面考慮,以90%甲醇作為樣品溶劑更有優(yōu)勢(shì)。

2.4 方法學(xué)驗(yàn)證 以感毒清顆粒和缺黃芪陰性顆粒劑樣品,照“2.1”項(xiàng)下“待考察的樣品溶劑”確定為“90%甲醇”,分別制備供試品和陰性樣品溶液,并以90%甲醇配制黃芪甲苷對(duì)照品溶液(0.508 mg·mL-1),進(jìn)行方法學(xué)考察。

2.4.1 專屬性實(shí)驗(yàn) 照“2.2”項(xiàng)下的色譜條件,取對(duì)照品、供試品和陰性樣品溶液各10μL進(jìn)樣,記錄色譜圖,結(jié)果顯示陰性無(wú)干擾。見(jiàn)圖1。

A.陰性樣品;B.黃芪甲苷對(duì)照品;C.供試品;1.黃芪甲苷?qǐng)D1 感毒清顆粒專屬性色譜圖A.negative sample;B.standard substance of astragaliⅣ;C. sample;1.astragaliⅣFig.1 Specificity chromatography for ganduqing granuless

2.4.2 線性關(guān)系考察 分別精密吸取黃芪甲苷對(duì)照品溶液5,10,15,20,25μL注入液相色譜儀,以黃芪甲苷濃度進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)(X),峰面積值的自然對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)(Y),進(jìn)行回歸分析,Y=1.672 8X+12.164,R2= 0.999 6。表明黃芪甲苷2.54～12.70μg呈良好的線性關(guān)系。

2.4.3 精密度實(shí)驗(yàn) 精密吸取黃芪甲苷對(duì)照品溶液10μL,連續(xù)測(cè)定6次,結(jié)果峰面積RSD=1.14%。

2.4.4 樣品溶液的穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取同一供試品溶液(批號(hào):20120314)10μL,分別于0,2,4,8,16 h測(cè)定,以外標(biāo)兩點(diǎn)法計(jì)算,結(jié)果黃芪甲苷含量值RSD= 1.23%,表明供試品溶液在16 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.4.5 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 稱取樣品6份(批號(hào): 20120314),照“2.1”項(xiàng)下“待考察的樣品溶劑”確定為“90%甲醇”制成供試品溶液,精密吸取黃芪甲苷對(duì)照品溶液10和20μL、供試品溶液10μL,測(cè)定,以外標(biāo)兩點(diǎn)法計(jì)算,黃芪甲苷含量平均值為0.914 9 mg·g-1, RSD=1.41%,表明本法重復(fù)性良好。

2.4.6 準(zhǔn)確度實(shí)驗(yàn) 采用加樣回收實(shí)驗(yàn):取已知準(zhǔn)確含量的樣品(批號(hào):20120314)6份,每份約2 g,精密稱定,分別加入黃芪甲苷對(duì)照品(2.02 mg·mL-1)1 mL,照“2.1”項(xiàng)下“待考察的樣品溶劑”確定為“90%甲醇”制成供試品溶液,精密吸取黃芪甲苷對(duì)照品溶液10和20μL、供試品溶液10μL,測(cè)定,以外標(biāo)兩點(diǎn)法計(jì)算黃芪甲苷含量,結(jié)果顯示平均回收率為100.04%,RSD= 2.83%。見(jiàn)表2。

表2 加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.2 Results of recovery test

2.4.7 樣品含量測(cè)定 分別取3批(批號(hào):120314, 120315,120316)感毒清顆粒,照“2.1”項(xiàng)下“待考察的樣品溶劑”確定為“90%甲醇”制成供試品溶液,精密吸取黃芪甲苷對(duì)照品溶液10和20μL、供試品溶液10μL,測(cè)定,以外標(biāo)兩點(diǎn)法計(jì)算黃芪甲苷含量。結(jié)果黃芪甲苷含量依次為0.92,0.94,0.91 mg·g-1,平均含量0.92 mg·g-1。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)是在采用《中華人民共和國(guó)藥典》2010年版一部測(cè)定黃芪及其制劑中黃芪甲苷含量過(guò)程中產(chǎn)生溶劑效應(yīng)時(shí)所進(jìn)行的探索性研究。筆者除嘗試了較原樣品溶劑(甲醇)強(qiáng)度更低的不同濃度的甲醇溶液和乙腈溶液外,曾嘗試先以甲醇、N,N-二甲甲酰胺或二甲亞砜將樣品溶解后再以流動(dòng)相稀釋后進(jìn)樣,樣品糊化現(xiàn)象依然嚴(yán)重;另外,通過(guò)降低樣品進(jìn)樣量(如5μL),若使其峰面積在黃芪甲苷對(duì)照品的兩點(diǎn)之間(外標(biāo)兩點(diǎn)法來(lái)計(jì)算含量),勢(shì)必降低對(duì)照品的濃度或進(jìn)樣量,在儀器靈敏度已確定的情況,此法將大大受限,故未作相應(yīng)的考察;最終選擇了對(duì)樣品溶解性能良好、可有效地消除溶劑效應(yīng)對(duì)含量測(cè)定影響的90%甲醇作為樣品溶劑,經(jīng)方法學(xué)驗(yàn)證是合理、可行的,將更有利黃芪及其制劑的中黃芪甲苷的質(zhì)量控制。

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DOI 10.3870/yydb.2014.12.022

Effect of Different Sam p le Solvents on Determ ination of AstragalosideⅣby High Performance Liquid Chromatograph-Evaporative Light Scattering Detector

XU Jing1,LIU Tian-qiang1,PENG Heng-yang1,XIAO Dan1,2
(1.Tongwei Co.,Ltd,Chengdu 610041,China;2. Chengdu University of Traditional Chinese Medicine,Chengdu 611137,China)

Objective To explore the effect of sample-solvent compositions on the determination of AstragaliⅣby high performance liquid chromatograph-evaporative light scattering detector(HPLC-ELSD).MethodsRadix astragali andganduqinggranules served as samples.Methanol,90%methanol,80%methanol,70%methanol,32%acetonitrile,15%acetonitrile, and water were sample solvents.HPLC-ELSD was used to determine content of astragalosideⅣ.ResultsThe results showed that the 90%methanol solution was an appropriate sample solventwith good system suitability,precision,accuracy,and,linearityetc..ConclusionThismethod benefits the quality control of astragalosideⅣin Radix astragali and agents containing Radix astragali.

AstragaliⅣ;Sample-solvent;Solvent effect;Chromatograph,high performance liquid;Detector,evaporative light scattering

R286;R927.2

B

1004-0781(2014)12-1624-04

2013-09-23

2014-03-14

*國(guó)家國(guó)際科技合作專項(xiàng)資助(2010DFA32380)

徐靜(1987-),男,四川南充人,工程師,碩士,主要從事藥物制劑與分析研究。電話:028-86168993,E-mail: 410744515@qq.com。

肖丹(1962-),女,四川成都人,教授,博士,主要從事藥劑學(xué)研究。電話:028-86168993,E-mail:xuj01@ tongwei.com。