李 峰,石 輝

西安建筑科技大學(xué)環(huán)境與市政工程學(xué)院,西安,710055

機(jī)體運(yùn)動(dòng)時(shí)所需能量主要來源于糖代謝。在大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)過程能促進(jìn)葡萄糖的轉(zhuǎn)運(yùn)[1],而機(jī)體正常組織會(huì)把葡萄糖代謝為乳酸,以供機(jī)體能量的需要,這必須依賴糖代謝限速酶的高度表達(dá)[2]。但是限速酶本身受多種變構(gòu)劑的影響,從而加速或減弱糖代謝的過程[3]。PM2.5作為空氣污染中一類主要污染物,其對(duì)人體健康所產(chǎn)生的危害效應(yīng)也備受關(guān)注[4-5],尤其是在運(yùn)動(dòng)狀態(tài)下,當(dāng)空氣中PM2.5超過了人體所能適應(yīng)或正常的生理范圍后,就會(huì)對(duì)機(jī)體的健康產(chǎn)生不良的效應(yīng)。因此,研究運(yùn)動(dòng)及不同濃度PM2.5暴露下機(jī)體糖代謝限速酶的變化特點(diǎn)和規(guī)律,以期為運(yùn)動(dòng)實(shí)踐中環(huán)境有害因子的監(jiān)控及探明PM2.5暴露劑量-運(yùn)動(dòng)反應(yīng)之間的關(guān)系機(jī)制提供一定的實(shí)驗(yàn)參考。

1 材料和方法(Materials and methods)

1.1 PM2.5的采樣及懸液制備

用TH-150C型(武漢天虹)大容量大氣總顆粒物智能采樣器(配加2.5 μm的切割器)進(jìn)行 PM2.5的采樣,采樣時(shí)間持續(xù)30 d,每天連續(xù)采樣24 h。采樣地點(diǎn)為某體育館內(nèi),周圍無障礙物遮擋且為非污染源,采樣前將采樣儀器放置高度為3～5 m,采用同心圓方式選取5個(gè)點(diǎn),兩點(diǎn)之間相距5 m左右,離墻＞1 m、離門窗＞3 m,采樣點(diǎn)高度1.5 m,即人體呼吸帶高度,空氣流量為1.13 m3·min-1。采樣時(shí)將已稱重的濾膜用鑷子放入結(jié)晶采樣夾的濾網(wǎng)上,濾膜毛面朝進(jìn)氣方向,將濾膜壓緊至不漏氣。采樣結(jié)束以后用鑷子取出濾膜,將有塵面兩次對(duì)折放入樣品紙袋并做好采樣記錄。將濾膜放在25℃,50%相對(duì)濕度的恒溫恒濕箱中平衡24 h,在此平衡條件下用感量為0.01 mg的分析天平稱量濾膜,記錄濾膜質(zhì)量,然后將同一濾膜再恒溫恒濕箱中同樣的條件下再平衡1 h后稱重,兩次重量之差小于0.04 mg為滿足恒重要求。根據(jù)采樣前、后濾膜質(zhì)量差和采樣體積得出顆粒物的質(zhì)量濃度。

懸液制備:將載有PM2.5的濾膜裁剪為小塊,浸入去離子水中,超聲振蕩30 min×4次,洗脫顆粒物,震蕩液經(jīng)6層紗布過濾,濾液4℃ 1000 rm·min-1離心20 min后收集下層懸液冷凍,PM2.5在-20℃保存。染毒時(shí),用0.9%生理鹽水配制成需要的濃度,使用前超聲振蕩混勻,滅菌備用。為保證顆粒物實(shí)際毒性效果,實(shí)驗(yàn)并未對(duì)顆粒物進(jìn)行消毒滅菌處理。

1.2 儀器與試劑

儀器:電動(dòng)跑臺(tái)(中國(guó)杭州段氏制作公司);DK-98-1A恒溫浴鍋(天津泰斯特有限公司);TN-100托盤扭力天平(武漢自動(dòng)化儀表廠);Bonso-TCS-2000A電子稱(武漢自動(dòng)化儀表廠);MR23i型低溫高速離心機(jī)(美國(guó)Thermo公司);TH-150C型大容量大氣總顆粒物智能采樣器(武漢天虹);BECKMAN AD 340化學(xué)發(fā)光酶標(biāo)儀(美國(guó))。

試劑:己糖激酶,丙酮酸激酶及異檸檬酸脫氫酶的活性均采用ELISA測(cè)定,試劑盒購(gòu)自上海雅吉生物科技有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組與運(yùn)動(dòng)方案

實(shí)驗(yàn)大鼠選用健康成年雄性Wistar SPF級(jí)大鼠30只(由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物房提供),鼠齡7周,體重180～220 g。大鼠購(gòu)入后適應(yīng)性喂養(yǎng)一周,自由進(jìn)食飲水(飼料購(gòu)自西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物房),動(dòng)物飼養(yǎng)室內(nèi)溫度(20～26)℃,濕度為44% ～70%,照明隨同自然變化。實(shí)驗(yàn)中對(duì)大鼠的處置按照中華人民共和國(guó)科學(xué)技術(shù)部頒布的《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見》的相關(guān)要求進(jìn)行[6]。將所有大鼠隨機(jī)分為QC,EC,LPE,MPE和HPE,按照每千克體重3 mL的劑量進(jìn)行設(shè)計(jì)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物每組8只,適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后,所有大鼠先以 10 m·min-1、5 min·天-1的跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)進(jìn)行2 d的適應(yīng)性訓(xùn)練,休息1 d后即按照設(shè)定的運(yùn)動(dòng)方案進(jìn)行一次遞增負(fù)荷訓(xùn)練,具體訓(xùn)練方案為:15 m·min-1×15 min,18 m·min-1×20 min,21 m·min-1×30 min,24 m·min-1×40 min,27 m·min-1×50 min 的遞增負(fù)荷形式進(jìn)行。

1.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物染毒劑量與染毒方式

PM2.5染毒采用氣管滴注法,滴注前受試動(dòng)物的溫度維持在37℃左右。乙醚麻醉后,染毒懸液預(yù)溫至37℃,經(jīng)氣管注入PM2.5顆粒物染毒懸液,滴注體積為3 mL·kg-1(體重)[7],注入后立即將大鼠直立并旋轉(zhuǎn),使顆粒物盡量均勻分布,染毒時(shí)間為訓(xùn)練前1h,對(duì)照組滴注同等容量的生理鹽水。

1.5 血清及肝臟組織勻漿制備

1.5.1 血液取樣及血清制備

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后即刻宰殺大鼠,用20% 烏拉坦溶液腹腔注射麻醉,腹主動(dòng)脈取血,采血位置的最佳穿刺點(diǎn)在腹主動(dòng)脈分叉處向心端1～3 mm處。將大鼠仰臥固定在手術(shù)臺(tái)上,常規(guī)消毒后用手術(shù)剪刀沿腹正中線剪開腹腔。右手持穿刺針,針尖斜面朝下,入針角度25°～30°,朝向心端方向刺入,深度以5 mm左右為宜,抽吸血液即可。取出的血液置37℃恒溫水浴5 min后3 500 r·min-1離心15 min,分離血清并 4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5.2 肝臟組織勻漿制備

大鼠宰殺后即刻稱取適量肝臟組織加入0.9%的生理鹽水,按W(g):V(ml)=1:9的比例加取預(yù)冷的勻漿介質(zhì)(pH 7.4,0.01 mol·L-1Tris-HCL,0.0001 mol·L-1EDTA-2 Na,0.01 mol·L-1蔗糖,0.8% 的 NaCl溶液)于燒杯中,用眼科小剪盡快剪碎組織塊(以上全部操作在冰水浴中進(jìn)行),然后倒入研缽中按照順時(shí)針方向進(jìn)行研磨至糊狀。勻漿液通過二層紗布過濾后按試劑盒要求分別于低溫冷凍離心機(jī)4 000 rpm·min-1離心l0 min,分離上清液,4℃冰箱保存?zhèn)溆没蚶洳鼗?20℃冰箱冰凍備用,使用前按照試劑盒要求作相應(yīng)的稀釋。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件處理,采用獨(dú)立樣本T檢驗(yàn),計(jì)算均值士標(biāo)準(zhǔn)差(X士s),確定差異的顯著性。

2 結(jié)果(Results)

2.1 PM2.5染毒對(duì)大鼠血清及肝臟組織HK活性的影響

如表1所示,與QC相比,EC組HK活性降低且差異據(jù)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.01)。和EC組相比,LPE,MPE組HK活性下降但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,HPE組HK活性下降且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.01)。

2.2 PM2.5染毒對(duì)大鼠血清及肝臟組織PK活性的影響

如表2所示,與QC相比,EC組血清和肝臟組織中PK活性降低且差異據(jù)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。和EC組相比,LPE組中PK活性下降,但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,MPE組HPE組PK活性下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05或 p＜0.01)。

2.3 PM2.5染毒對(duì)大鼠血清及肝臟組織IDH的影響

和QC組相比,EC組血清和肝臟組織中IDH活性均升高,差異據(jù)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。和EC組相比,隨著染毒劑量的增加,IDH活性下降更加明顯,且MPE組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05或p＜0.01),HPE組肝臟組織IDH差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05或p＜0.01)。

表1 PM2.5染毒對(duì)大鼠血清及肝臟組織HK活性的影響Table 1 The HK activities change of serum and liver of rats exposed in PM2.5(nmo·lmg-1)

表2 PM2.5染毒對(duì)大鼠血清及肝臟組織PK活性的影響Table 2 The PK activities change of serum and liver of rats exposed in PM2.5(nmo·lmg-1)

表3 PM2.5染毒對(duì)大鼠血清及肝臟組織IDH的影響Table 3 The IDH activities of serum and liver of rats exposed in PM2.5(nmo·lmg-1)

3 討論(Discussion)

3.1 運(yùn)動(dòng)對(duì)大鼠HK,PK,IDH活性的影響

環(huán)境與運(yùn)動(dòng)健康是環(huán)境毒理學(xué)和運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)領(lǐng)域內(nèi)共同關(guān)注的重要課題之一。一方面,運(yùn)動(dòng)時(shí)物質(zhì)與能量代謝均需各種酶的催化;另一方面,運(yùn)動(dòng)會(huì)引起酶發(fā)生適應(yīng)性變化,表現(xiàn)出運(yùn)動(dòng)性質(zhì)與代謝特點(diǎn)的相適應(yīng)。

在本實(shí)驗(yàn)中,和空白對(duì)照相比,運(yùn)動(dòng)對(duì)照組糖酵解限速酶HK及PK活性均降低,且差異據(jù)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.01),其主要原因是本運(yùn)動(dòng)方案為有氧運(yùn)動(dòng)模型,機(jī)體雖持續(xù)運(yùn)動(dòng)時(shí)間長(zhǎng),但總體的運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度不大,不足以啟動(dòng)機(jī)體的無氧代謝能力來動(dòng)員更多的ATP以維持運(yùn)動(dòng)需要。而HK及PK為糖酵解的限速酶,其活性的變化主要與短時(shí)間大強(qiáng)度的運(yùn)動(dòng)有關(guān),由于此時(shí)機(jī)體的有氧氧化供能系統(tǒng)足以提供運(yùn)動(dòng)所需的能量,因此HK及PK沒有出現(xiàn)上升的現(xiàn)象。另外,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)也顯示,運(yùn)動(dòng)后有氧氧化限速酶IDH活性升高,這表明本實(shí)驗(yàn)運(yùn)動(dòng)方案可以促進(jìn)機(jī)體有氧氧化代謝能力的增強(qiáng),同時(shí)IDH活性升高也表明組織氧利用能力提高,保證組織收縮時(shí)的能量供應(yīng),提高肌肉的工作效率和運(yùn)動(dòng)持久能力。這主要是因?yàn)槟芰看x相關(guān)酶活性的變化最能迅速地反映各種訓(xùn)練期組織亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的適應(yīng)和有氧代謝能力的水平,因此,有氧運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練可引起IDH活性的改變也是機(jī)體對(duì)運(yùn)動(dòng)適應(yīng)的一種表現(xiàn)。另外,HK及PK一般存在于細(xì)胞液中,而血清中檢測(cè)到此兩種酶活性的變化,主要原因應(yīng)歸結(jié)于兩方面:1)運(yùn)動(dòng)時(shí)肝組織細(xì)胞膜或其他器官中一些細(xì)胞膜受損使膜通透性增加,細(xì)胞膜對(duì)流通物質(zhì)分子的選擇能力下降,導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的酶釋放入血液。2)當(dāng)細(xì)胞受到損傷時(shí),酶從細(xì)胞內(nèi)逸出進(jìn)入細(xì)胞外液,引起血清中酶活性的增加[8]。

3.2 PM2.5染毒暴露對(duì)運(yùn)動(dòng)大鼠HK,PK,IDH活性的影響

PM2.5對(duì)肺功能存在短期負(fù)效應(yīng),并存在一定滯后性[9],可造成呼吸、心血管、免疫等多系統(tǒng)的健康損害,并與人群呼吸系統(tǒng)和心血管系統(tǒng)的發(fā)病率和死亡率有關(guān)[10-12]。本實(shí)驗(yàn)中表1,2,3數(shù)據(jù)顯示,PM2.5染毒后HK,PK,IDH 3種酶活性均下降,且下降幅度與染毒劑量呈相關(guān)表達(dá)。雖然此3種酶活性的改變并不絕對(duì)代表無氧或者有氧代謝能力的變化[13],但是PM2.5染毒后HK,PK,IDH活性的改變也在一定程度上表明PM2.5染毒可以對(duì)機(jī)體的糖代謝酶產(chǎn)生不利的影響。分析其原因主要有以下幾個(gè)方面:(1)近年來許多學(xué)者認(rèn)為,檢測(cè)IDH活性能較準(zhǔn)確地反映出肝細(xì)胞病變程度,尤其是壞死性變化,因此臨床上較多地用于測(cè)定人體血清中IDH活性為判斷肝細(xì)胞病變的依據(jù)。PM2.5中含有大量的無機(jī)和有機(jī)化合物,能夠誘發(fā)肝臟纖維化,而在機(jī)體的供能系統(tǒng)中,糖類首先以肝糖原的形式存儲(chǔ)在肝臟中,然后進(jìn)行代謝和轉(zhuǎn)化,當(dāng)肝臟機(jī)能受損時(shí),其作為貯存和代謝、解毒的功能必將減弱,當(dāng)作為無氧和有氧代謝的底物減少時(shí),糖代謝的整個(gè)過程也必將受到影響。(2)另外,作者以前的研究發(fā)現(xiàn),PM2.5染毒后大鼠血清和一些組織中的抗氧化酶活性降低[14],表明顆粒物具有產(chǎn)生或誘導(dǎo)產(chǎn)生自由基的能力,而自由基會(huì)與PM2.5的化學(xué)成分產(chǎn)生加合作用,誘導(dǎo)體內(nèi)的酶和蛋白質(zhì)發(fā)生環(huán)氧化反應(yīng)并導(dǎo)致糖代謝底物的變構(gòu),從而影響底物與酶的楔合效應(yīng),導(dǎo)致代謝酶生成量減少和活性的降低。(3)呼吸系統(tǒng)受到的PM2.5污染效應(yīng)與其沉積于呼吸系統(tǒng)的污染量有關(guān)。而沉積率與呼吸頻率、呼吸量成正比。呼吸頻率、呼吸量值越大,沉積率的值就越高,污染效應(yīng)就越大,由于本運(yùn)動(dòng)方案總的運(yùn)動(dòng)時(shí)間累計(jì)為155 min,所以大鼠的總肺通氣量較大,使得PM2.5的沉積量要比安靜時(shí)大,這對(duì)于糖代謝關(guān)鍵酶的高度表達(dá)也是不利的。

暴露-反應(yīng)關(guān)系是指環(huán)境暴露水平與人體不良反應(yīng)發(fā)生之間的關(guān)系,在空氣污染流行病學(xué)研究中通常是指隨著空氣污染物濃度的改變,人群中出現(xiàn)某種健康損害的個(gè)體在群體中所占比例的相應(yīng)變化,也稱濃度-反應(yīng)關(guān)系。而閾值濃度是指污染物濃度在低于該濃度值時(shí),流行病學(xué)研究未觀察到空氣污染物對(duì)人群健康的影響。關(guān)于HK,PK,IDH 3種酶活性的降低與PM2.5染毒劑量的相關(guān)性,說明機(jī)體對(duì)PM2.5的承載存在一定的閾值。在本實(shí)驗(yàn)中,低劑量組PM2.5雖然可以使3種酶活性下降,但是都不具有差異顯著性,而中劑量和高劑量組均差異均表現(xiàn)出具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,說明針對(duì)于本實(shí)驗(yàn)來說,大鼠在15 mg·kg-1和30 mg·kg-1的劑量時(shí)才會(huì)對(duì)機(jī)體產(chǎn)生明顯的毒性作用,這也說明在同樣的運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度和運(yùn)動(dòng)量下,環(huán)境污染越嚴(yán)重,PM2.5對(duì)機(jī)體正常生理功能的干擾和損害越大。雖然流行病學(xué)研究以及實(shí)驗(yàn)室研究均提出大氣顆粒物的健康影響存在劑量-反應(yīng)關(guān)系,但關(guān)于大氣顆粒物對(duì)人體的作用閾值的研究,特別是實(shí)驗(yàn)室方面涉及較少,所取得的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究成果對(duì)于人群的外推有不確定性。因此,目前研究還未確定針對(duì)不同性別、不同年齡、不同運(yùn)動(dòng)狀態(tài)、不同生活環(huán)境下,細(xì)顆粒是否存在不同的閾值,我們的研究目的也是通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)探索PM2.5污染的運(yùn)動(dòng)環(huán)境下機(jī)體對(duì)不同的PM2.5劑量濃度的反應(yīng)。因?yàn)閯?dòng)物染毒劑量組的設(shè)置需考慮多種綜合因素,包括大鼠每天的通氣量(0.80 L·kg-1體重),大氣PM2.5在肺部的沉積率(20%左右)等。在本實(shí)驗(yàn)之前的預(yù)實(shí)驗(yàn)過程中,除了7.5,15和30 mg·kg-1我們還設(shè)計(jì)了1 mg·kg-1,5 mg·kg-1的劑量組,但是通過預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)1 mg·kg-1對(duì)大鼠無影響,5 mg·kg-1對(duì)空白對(duì)照組無影響,而對(duì)運(yùn)動(dòng)對(duì)照組有影響但無差異不具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(未發(fā)表數(shù)據(jù))。而在本論文中所設(shè)置的7.5 mg.kg-1的劑量濃度與運(yùn)動(dòng)對(duì)照組相比時(shí),雖說酶的活性有升高或者降低的變化,但差異均未有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,說明在本實(shí)驗(yàn)所設(shè)置的外部環(huán)境條件下,機(jī)體代謝酶所能承受的暴露劑量閾值下限為7.5-15 mg·kg-1,但由于本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的最高劑量為30 mg·kg-1,雖然說數(shù)據(jù)顯示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,但是否為機(jī)體所能承受的閾值上限濃度尚不能確定。這也提示相關(guān)環(huán)境監(jiān)測(cè)部門和運(yùn)動(dòng)者在運(yùn)動(dòng)時(shí)要注意PM2.5的濃度變化,因?yàn)檫@可能是會(huì)導(dǎo)致運(yùn)動(dòng)能力下降和健康效應(yīng)受損的一個(gè)重要因素。

綜上所述,我們認(rèn)為(1)本實(shí)驗(yàn)運(yùn)動(dòng)方案可以降低血清和肝臟組織中HK,PK的活性,而使IDH活性升高,表現(xiàn)出運(yùn)動(dòng)性質(zhì)與代謝特點(diǎn)的相適應(yīng);(2)PM2.5染毒后HK,PK,IDH活性均下降,且呈劑量反應(yīng)關(guān)系。

致謝:感謝四川大學(xué)康啟智和陜西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院楊瑾博士的幫助和支持。

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