嚴(yán)德凱,劉兆普,隆小華

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院江蘇省海洋生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇南京210095)

菊芋試管苗的初代培養(yǎng)及愈傷組織不定芽誘導(dǎo)

嚴(yán)德凱,劉兆普,隆小華①

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院江蘇省海洋生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇南京210095)

菊芋(Helianthus tuberosus Linn.)為菊科(Asteraceae)向日葵屬(Helianthus Linn.)多年生草本植物,耐寒、耐旱、耐貧瘠、耐鹽堿[1];其地下塊莖富含菊糖,還可通過(guò)發(fā)酵生產(chǎn)乙醇,在功能性食用多糖及生物能源方面的開(kāi)發(fā)潛力巨大。菊芋主要通過(guò)塊莖進(jìn)行無(wú)性繁殖,其種子成活率和發(fā)芽率均很低[2],嚴(yán)重阻礙了菊芋的雜交育種。近年來(lái)以植物組織培養(yǎng)為基礎(chǔ)的一系列現(xiàn)代育種技術(shù)為菊芋的種質(zhì)改良提供了新途徑,但由于菊芋的愈傷組織難以誘導(dǎo)不定芽或體胚發(fā)生,導(dǎo)致以農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化為主的轉(zhuǎn)基因育種技術(shù)的應(yīng)用受到限制。因此,建立高效穩(wěn)定的組織培養(yǎng)再生體系是菊芋分子育種工作的關(guān)鍵。

作者以耐鹽、耐澇且高產(chǎn)的菊芋品種‘南芋9號(hào)’(‘Nanyu 9’)為實(shí)驗(yàn)材料,研究其試管苗初代培養(yǎng)條件并比較不同外植體愈傷組織不定芽發(fā)生的差異,以期為建立高效穩(wěn)定的菊芋組織培養(yǎng)再生體系提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)和參考。

1 材料和方法

1.1 材料

供試菊芋品種‘南芋9號(hào)’種子和塊莖均由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)海岸帶資源實(shí)驗(yàn)室提供,均采自江蘇省鹽城市大豐市金海農(nóng)場(chǎng)。種子于2012年9月至11月采集,置于4℃冰箱干燥保存;塊莖于2012年11月收獲,置于4℃冰箱春化3個(gè)月以上。

1.2 方法

1.2.1 無(wú)菌試管苗培養(yǎng) 在溫室中通過(guò)沙培方法獲得菊芋塊莖無(wú)性繁殖幼苗,當(dāng)苗高5～10 cm時(shí)剪取莖尖和帶腋芽的莖段,流水沖洗1 h,在超凈工作臺(tái)上依次用體積分?jǐn)?shù)70%乙醇消毒30～60 s、質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)4%NaClO溶液消毒5～10 min,無(wú)菌水沖洗5～6遍;用無(wú)菌濾紙吸干水分,莖段切成長(zhǎng)0.5～1.0 cm,將莖尖和帶腋芽的莖段形態(tài)學(xué)下端朝下分別接種到添加0.00、0.05和0.10 mg·L-1NAA以及0.00、0.25和0.50 mg·L-16-BA的MS初代培養(yǎng)基(pH 5.6～pH 5.8)中,共9種激素組合。每瓶接種4個(gè)外植體,置于溫度25℃、光照度1 500～1 800 lx、光照時(shí)間16 h·d-1的光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng),3～4周后觀察并記錄外植體發(fā)芽狀況。每種培養(yǎng)基接種30個(gè)外植體,每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

以生長(zhǎng)健壯、無(wú)玻璃化的再生苗的莖尖和帶腋芽莖段為外植體,接種到MS培養(yǎng)基上進(jìn)行繼代增殖培養(yǎng),獲得無(wú)菌試管苗。

外植體的發(fā)芽百分率、玻璃化苗百分率和正常苗百分率的計(jì)算公式分別為:發(fā)芽百分率=(發(fā)芽外植體數(shù)/接種外植體總數(shù))×100%;玻璃化苗百分率=(發(fā)生玻璃化的試管苗數(shù)/萌發(fā)的試管苗總數(shù))×100%;正常苗百分率=(正常的試管苗數(shù)/接種的外植體總數(shù))×100%。

1.2.2 種子萌發(fā)培養(yǎng) 將菊芋種子去殼,置于超凈工作臺(tái)內(nèi),先用無(wú)菌水振蕩沖洗2遍,依次用體積分?jǐn)?shù)70%乙醇消毒10～30 s、質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)4%NaClO溶液消毒5～10 min,無(wú)菌水沖洗5～6遍;用無(wú)菌濾紙吸干水分,將種子接種到MS培養(yǎng)基上,每瓶接種16～23粒種子,每次接種至少100粒種子,置于溫度25℃條件下暗培養(yǎng)2～3 d,然后轉(zhuǎn)至光照度1 500～1 800 lx、光照時(shí)間16 h·d-1的條件下培養(yǎng)1～2 d,獲得無(wú)菌的菊芋幼苗。

1.2.3 愈傷組織誘導(dǎo)和不定芽發(fā)生 參照文獻(xiàn)[3]以及作者前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果配制愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基:改良MS培養(yǎng)基(含200 mg·L-1肌醇、80 g·L-1蔗糖、8 g·L-1瓊脂和500 mg·L-1水解酪蛋白),添加0.05 mg·L-1NAA和0.06 mg·L-16-BA (pH 5.6～pH 5.8)。

按照如下方法獲取不同的外植體:菊芋塊莖洗凈并去皮,切成邊長(zhǎng)1～2 cm方塊,置于超凈工作臺(tái)內(nèi),先用無(wú)菌水振蕩沖洗2遍,然后依次用體積分?jǐn)?shù)70%乙醇消毒30～60 s、質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)4%NaClO溶液消毒10～15 min,無(wú)菌水沖洗5～6遍,無(wú)菌濾紙吸干水分,切掉表面壞死組織,切成面積0.5 cm× 0.5 cm、厚1～2 mm的小塊;取上述無(wú)菌試管苗的葉片,切成面積0.5 cm×0.5 cm的小片;取上述無(wú)菌試管苗的不帶腋芽和莖尖的莖段,切成長(zhǎng)0.3～0.5 cm小段;取上述經(jīng)種子萌發(fā)獲得的無(wú)菌幼苗,切下子葉并去掉葉尖部分。將莖段以及塊莖切片水平接種至誘導(dǎo)培養(yǎng)基上、葉片和子葉正面朝上接種至誘導(dǎo)培養(yǎng)基上,置于溫度25℃條件下暗培養(yǎng)3～4周,觀察愈傷組織誘導(dǎo)和不定芽發(fā)生狀況;之后轉(zhuǎn)移到光照度1 500～1 800 lx、光照時(shí)間16 h·d-1條件下繼續(xù)培養(yǎng)2～4周;每種外植體接種約20個(gè),實(shí)驗(yàn)重復(fù)2次。觀察愈傷組織誘導(dǎo)狀況并統(tǒng)計(jì)不定芽誘導(dǎo)率,其計(jì)算公式為:不定芽誘導(dǎo)率=(形成不定芽的外植體數(shù)/接種的外植體總數(shù))×100%。

1.3 數(shù)據(jù)處理

應(yīng)用SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,并采用Duncan’s新復(fù)極差法進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果和分析

2.1 在添加不同激素配比的培養(yǎng)基中菊芋無(wú)菌試管苗初代培養(yǎng)結(jié)果比較

在添加不同質(zhì)量濃度NAA和6-BA的培養(yǎng)基上菊芋無(wú)菌試管苗的培養(yǎng)結(jié)果見(jiàn)表1。由表1可見(jiàn):在9種培養(yǎng)基上菊芋外植體的發(fā)芽百分率均較高,均在60%以上。但試管苗都出現(xiàn)不同程度的玻璃化現(xiàn)象,同時(shí)外植體上生成大塊的非胚性愈傷組織(圖1-A),這種非胚性愈傷組織生長(zhǎng)速度快,體積較大,含水量高,多呈透明或淡黃色半透明狀,無(wú)再分化能力。除C1培養(yǎng)基(不添加NAA和6-BA)外,其他8種培養(yǎng)基的玻璃化苗百分率均在80%以上?？傮w上看,C1培養(yǎng)基的培養(yǎng)效果最好,試管苗的發(fā)芽百分率為95.81%、玻璃化苗百分率為68.32%、正常苗百分率為30.18%。

2.2 菊芋不同外植體的愈傷組織和不定芽誘導(dǎo)結(jié)果比較

研究結(jié)果表明:以菊芋塊莖、試管苗葉片、不帶腋芽和莖尖的莖段以及子葉作為外植體,接種至誘導(dǎo)培養(yǎng)基上均可形成愈傷組織,并生成不定根。其中,由塊莖誘導(dǎo)形成的愈傷組織為白色、結(jié)構(gòu)致密,表面有少量不定根;葉片、不帶腋芽和莖尖的莖段以及子葉形成的愈傷組織類(lèi)似,均在切口處形成白色或淡黃色的半透明或不透明的愈傷組織,并生成較多的不定根。在菊芋4種外植體誘導(dǎo)形成的愈傷組織中,僅子葉的愈傷組織可以進(jìn)一步分化生成不定芽(圖1-B),其中少數(shù)愈傷組織通過(guò)體胚途徑分化形成體胚(圖1-C);在光照條件下不定芽轉(zhuǎn)綠(圖1-D)并伸長(zhǎng)生長(zhǎng),但不定芽的誘導(dǎo)百分率僅有14.3%。

表1 在添加不同質(zhì)量濃度NAA和6-BA的培養(yǎng)基中菊芋試管苗的初代培養(yǎng)結(jié)果比較(SD)1)Table1 Comparison on primary culture result of Helianthus tuberosus Linn.plantlet on media added with different mass concentrations of NAA and 6-BA(SD)1)

表1 在添加不同質(zhì)量濃度NAA和6-BA的培養(yǎng)基中菊芋試管苗的初代培養(yǎng)結(jié)果比較(SD)1)Table1 Comparison on primary culture result of Helianthus tuberosus Linn.plantlet on media added with different mass concentrations of NAA and 6-BA(SD)1)

1)同列中不同的小寫(xiě)字母表示在0.05水平上差異顯著Different small letters in the same column indicate the significant difference at 0.05 level.

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圖1 菊芋試管苗初代培養(yǎng)及其子葉愈傷組織誘導(dǎo)過(guò)程中外植體形態(tài)的變化Fig.1 Primary culture of Helianthus tuberosus Linn.plantlet and explant morphology change during induction process of cotyledon callus

3 討 論

菊芋是愈傷組織難再生的植物之一[4],其同屬植物向日葵(Helianthus annuus Linn.)在組織培養(yǎng)過(guò)程中也有類(lèi)似的問(wèn)題。有關(guān)向日葵組織培養(yǎng)研究自20世紀(jì)80年代就已開(kāi)始,但仍然存在植株再生困難和重復(fù)性差等問(wèn)題[5]。劉海臣[6]認(rèn)為:向日葵的愈傷組織再生受多種因素制約,如基因型、外植體類(lèi)型、無(wú)菌苗日齡和內(nèi)外源激素等,其中,以子葉、下胚軸、莖尖和未成熟胚作為外植體較易誘導(dǎo)出再生植株。在菊芋的組織培養(yǎng)過(guò)程中,目前研究者多以其塊莖、莖尖或帶腋芽莖段為外植體[7-10],而對(duì)菊芋子葉或下胚軸的愈傷組織再生的研究尚不多見(jiàn)。作者選擇優(yōu)良的菊芋栽培品種‘南芋9號(hào)’為材料,研究了塊莖、試管苗葉片、不帶腋芽和莖尖的莖段以及子葉4種外植體的愈傷組織不定芽再生能力,結(jié)果表明:由子葉誘導(dǎo)的愈傷組織的不定芽再生能力明顯優(yōu)于塊莖、葉片以及不帶腋芽和莖尖的莖段,對(duì)菊芋組織培養(yǎng)而言是較為理想的外植體類(lèi)型。但目前不定芽的誘導(dǎo)率較低,僅有14.3%,愈傷組織再生體系也并不完善,均有待進(jìn)一步的優(yōu)化。此外,在菊芋的初代培養(yǎng)過(guò)程中存在較為嚴(yán)重的玻璃化現(xiàn)象,這一現(xiàn)象在有關(guān)菊芋組織培養(yǎng)的文獻(xiàn)中未見(jiàn)報(bào)道,可能與品種本身的遺傳特性以及消毒劑對(duì)外植體的傷害有關(guān)。總之,菊芋品種‘南芋9號(hào)’的組織培養(yǎng)再生體系還需要進(jìn)一步優(yōu)化。

[1] 陸 艷,葉慧君,耿守保,等.NaCl脅迫對(duì)菊芋幼苗生長(zhǎng)和葉片光合作用參數(shù)以及體內(nèi)離子分布的影響[J].植物資源與環(huán)境學(xué)報(bào),2010,19(2):86-91.

[2] KAYS S J,NOTTINGHAM S F.Biology and Chemistry of Jerusalem Artichoke:Helianthus tuberosus L.[M].Boca Raton:CRC Press, 2007.

[3] FIORE M C,TRABACE T,SUNSERI F.High frequency of plant regeneration in sunflower from cotyledons via somatic embryogenesis [J].Plant Cell Reports,1997,16:295-298.

[4] 陳 軍.體外誘變與組織培養(yǎng)在菊芋種質(zhì)創(chuàng)新中的應(yīng)用研究[D].武漢:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)植物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,2009:7-8.

[5] 劉海學(xué),王 罡,季 靜,等.向日葵(Helianthus annuus L.)不同外植體組織培養(yǎng)及其再生的研究[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué),2006, 39(11):2208-2213.

[6] 劉海臣.向日葵下胚軸組織培養(yǎng)及其遺傳轉(zhuǎn)化的研究[D].長(zhǎng)春:長(zhǎng)春理工大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院,2007:3-6.

[7] 王利琳,陳立明.菊芋的組織培養(yǎng)及植株再生[J].植物生理學(xué)通訊,1997,33(5):358.

[8] 閆海霞,汪衛(wèi)星,向素瓊,等.菊芋的組織培養(yǎng)與快繁技術(shù)研究[J].南方農(nóng)業(yè),2009,3(2):58-61.

[9] 潘 宇,龐少萍,鄒 卓,等.菊芋快速繁殖與植株再生研究[J].西南大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版,2013,35(12):16-20.

[10] 陸 杰,宋 洋,王 珣,等.菊芋組織培養(yǎng)快繁技術(shù)的建立[J].植物生理學(xué)通訊,2010,46(5):459-465.

(責(zé)任編輯:張明霞)

Primary culture of Helianthus tuberosus plantlet and its adventitious bud induction from callusYAN Dekai,LIU

Zhaopu,LONG Xiaohua①(Key Laboratory of Marine Biology of Jiangsu Province,College of Resources and Environmental Sciences,Nanjing Agricultural University,Nanjing 210095,China),J.Plant Resour.&Environ.2014,23(4):108-110

Effect of NAA and 6-BA with different mass concentrations on primary culture of Helianthus tuberosus‘Nanyu 9’plantlet was researched,and induction result of different explants was compared.The results show that the primary culture result of shoot tip and stem with axillary bud of H.tuberosus on MS medium without adding NAA and 6-BA is the best,and its germination percentage and normal seedling percentage are the highest(95.81%and 30.18%,respectively),and vitrified seedling percentage is the lowest(only 68.32%).Taking tuber,leaf of plantlet,stem without axillary bud and shoot tip and cotyledon of H.tuberosus as explants,callus can be induced on induction medium(improved MS medium added with 0.05 mg·L-1NAA and 0.06 mg·L-16-BA,pH 5.6-pH 5.8),while only callus from cotyledon can form adventitious bud and induction rate of adventitious bud is only 14.3%.

菊芋;試管苗;外植體;組織培養(yǎng);愈傷組織;不定芽

Helianthus tuberosus Linn.;plantlet;explant;tissue culture;callus;adventitious bud

Q943.1;S632.9

A

1674-7895(2014)04-0108-03

10.3969/j.issn.1674-7895.2014.04.17

2013-12-24

江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新資金項(xiàng)目〔CX(12)1005-1;CX(12)1005-3〕;國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31201692);國(guó)家“十二五”科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2011BAD13B09);中央高校基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)項(xiàng)目(Y0201100249)

嚴(yán)德凱(1989—),男,山東青島人,碩士研究生,主要從事耐鹽植物快繁和組培方面的研究。

①通信作者E-mail:longxiaohua@njau.edu.cn