向羿全

摘 要：本次試驗用人工培養(yǎng)的灰霉菌經(jīng)過過濾、濃縮、化學(xué)試劑萃取后取得的毒素侵染擬南芥，導(dǎo)致植物葉片產(chǎn)生病變。試驗表明，隨溫度升高，毒性增強；隨稀釋倍數(shù)增加，毒性降低；最適pH值為6.6。

關(guān)鍵詞：灰霉菌；擬南芥；毒素；致病性；致病率

1.試驗材料、器材：野生型擬南芥、電子、滅菌鍋、超凈工作臺、移液槍、發(fā)酵罐、電磁爐、真空泵、分液漏斗、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器、無菌注射器及針頭、pH儀、離心管、恒溫水浴鍋、搖床等。

2.試驗試劑：PDA培養(yǎng)基、95%酒精、0.1%Hgcl、正己烷、甲醇、石油醚、三氯甲烷、0.1mol/L氫氧化鈉、0.1mol/L鹽酸等。

3.試驗方法：種植擬南芥：將野生型擬南芥種子，放入2mL的離心管（150粒左右）；離心管中加入無菌水1.5mL，浸泡30min；用95%的乙醇浸泡5min；用0.1%Hgcl浸泡5min；用無菌水浸泡5min（重復(fù)）；均勻播種于培養(yǎng)皿中，放入4℃冰箱保存兩天；取出培養(yǎng)皿置于組培室；待培養(yǎng)皿中種子長出兩片真葉后移栽至滅

菌花（4棵/盆）；蓋保鮮膜，放入組培室，定期澆水，保持培養(yǎng)室的溫度在25℃左右。

配制土豆培養(yǎng)基：200g土豆配制1L培養(yǎng)基、20g蔗糖、20g瓊脂。

灰霉菌次生代謝產(chǎn)物的獲得：在實驗室的條件下，配制液體培養(yǎng)基，接種灰霉菌，置于搖床內(nèi)培養(yǎng)5天左右，待觀察到培養(yǎng)瓶內(nèi)出現(xiàn)較大菌絲體時，接種于發(fā)酵罐內(nèi)，在200轉(zhuǎn)/分的速度、罐內(nèi)壓力保持0.5千帕下發(fā)酵培養(yǎng)6～7天。培養(yǎng)結(jié)束后，取出發(fā)酵液后，經(jīng)過濾、濃縮得到次生代謝物。

化學(xué)萃取毒素：稱取20g樣品，加入40mL的正己烷，移入分液漏斗，用40ml甲醇水溶液分次沖洗容器，洗液并入分液漏斗；震搖2min，靜置分層，將下層甲醇水溶液用40mL三氯甲烷萃取，震搖2min，靜置分層；取下層三氯甲烷，經(jīng)用三氯甲烷濕潤過的10g無水硫酸鈉和定量慢速濾紙過濾，濾液倒入蒸發(fā)皿；再用5mL三氯甲烷反復(fù)萃取，用少量三氯甲烷過濾濾液，洗液并入蒸發(fā)皿；通風(fēng)揮干，收集毒素。

濃縮毒素保存：使用恒溫水浴鍋，在90℃下濃縮至樣液原來的三分之一，置于-20℃的冰箱內(nèi)保存。

毒素致病性測試：由于毒素長時間保存，在試驗開始前，需對毒素的致病性進行測試。選取10片長勢相近的擬南芥葉片，標(biāo)記后，用無菌的一次性針頭在葉片戳一小孔，用針筒侵染毒素，置于培養(yǎng)室內(nèi)培養(yǎng)、觀察。

4.毒素測試：不同濃度下的致病率：取滅菌后的容器，注入1mL濃縮毒素，加入無菌水，分別稀釋10×、50×、100×、200×、500×、700×、1000×。按照致病性測試方法，分別侵染30片生長良好的擬南芥葉片，并用無菌水作為實驗對照，培養(yǎng)，至病斑穩(wěn)定為止，記錄并計算致病率（3次重復(fù)）。

不同pH下的致病率：試驗之前，先測試毒素的pH，制定pH梯度為4、5、6、7、8。取滅菌后的細(xì)口瓶，分別配制0.1mol/L濃度的鹽酸和0.1mol/L濃度的氫氧化鈉，再取五支滅菌后的試管加入1ml的毒素樣液，加入鹽酸和氫氧化鈉配制成pH為4、5、6、7、8的毒素液，以毒素自身pH6為對照組。分別侵染30片生長良好的擬南芥葉片，置于培養(yǎng)室內(nèi)觀察，至病斑穩(wěn)定，計算致病率。（3次重復(fù)）

不同溫度下的致病率：取五支滅菌后的試管，加入1mL的毒素，分別置于40℃、60℃、80℃、100℃、120℃下處理30min后，對擬南芥進行浸染，置于培養(yǎng)室內(nèi)觀察，至病斑穩(wěn)定，計算致病率。（3次重復(fù)）

在pH基礎(chǔ)上測定毒素毒性的最適pH值：由上可知pH6-7之間存在最適pH值。取四支潔凈的試管，加入等量的毒素樣液，用氨水調(diào)整pH6.2、6.4、6.6、6.8，分別侵染30片擬南芥葉片，觀察。（3次重復(fù)）

5.結(jié)論：隨毒素濃度的降低，毒性也逐漸降低；隨著pH值的增加，毒素的毒性增強，7以后隨pH值的增加，毒性降低；6.6是毒素的最適pH；隨著溫度的升高，毒素的毒性增強。說明不同的環(huán)境條件對毒素的毒性有一定的影響。

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（作者單位 云南省玉溪市師院附中）

編輯 馬燕萍endprint